CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.7.3. Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite
Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của các chủng được đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trường nuôi cấy.
Nguyên tắc:
Phản ứng giữa nitrite và hỗn hợp sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước sóng 540 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Dung dịch sunfanylamide: cân 0,6 g NH2C6H4SO2NH2 hòa tan trong 50 ml
nước cất nóng, làm lạnh, thêm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.
Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0.1 g
C10H7NHCH2NH2.2HCl hòa tan trong 100 ml nước cất, đựng trong chai màu nâu, bảo quản 4oC.
Lập đường chuẩn:
Chuẩn bị các ống thí nghiệm.
Hòa tan 1,23 g NaNO2 trong 1000 ml nước cất. Dung dịch gốc có nồng độ
N- NO2 là 250 mg/l.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dd gốc. Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.
Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau. Thêm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.
Trộn đều và giữ yên trong 5 phút. Thêm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl.
Trộn đều và giữ yên trong 10 phút. So màu ở bước sóng 540 nm.
2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng xử lý photpho
Khả năng tích lũy photpho của các chủng được đánh giá thông qua sự giảm nồng độ của PO4- trong môi trường nuôi cấy theo thời gian.
Chuẩn bị thuốc thử:
Chuẩn bị dung dịch (NH4)6Mo6
Hòa tan 7,27 g amonium molydat (NH4)6Mo7O2.4H2O (sấy ở 105oC trong 3
giờ) vào 150 ml nước cất.
Hòa tan 0,0945 g Kaly antimon tactrat (C8H8O12K2.Sb2O2.H2O) trong 50ml
nước cất.
96 ml H2SO4 đặc vào bình chứa 600 ml nước cất sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
Trộn các dung dịch trên với nhau
Thêm vào 10 g amonium amidosulfat (NH4OSO2NH2) vào hỗn hợp dung
dịch trên
Định mức đến 1000 ml
Chuẩn bị dung dịch C6H8O6: Hòa tan 1.8 g C6H8O6 trong 25 ml nước, sử dụng trong vòng 2 tuần.
Lập đường chuẩn
Chuẩn bị dãy các dung dịch gồm 5 điểm vào 5 ống nghiệm có chia vạch Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,4394g KH2PO4 trong 100 ml nước cất. Dung dịch chuẩn: pha loãng dung dịch gốc 20 lần ta được dung dịch chuẩn 5 mg/l. Lấy dung dịch chuẩn theo tỷ lệ nồng độ sau:
Nồng độ (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Vdd chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi tiến hành lấy dung dịch chuẩn và lấy mẫu vào ống nghiệm định mức
tới 40 ml
Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6 Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút Đo mẫu tại bước sóng 710 nm
2.3.8.1. Phương pháp phân tích photpho tổng
Nguyên tắc: Amonium molydat và kali antimon tatrat phản ứng với PO43- trong mơi trường axit trung bình tạo thành axit photpho molipdic có màu xanh đậm đo màu ở bước sóng 710 nm trên máy quang phổ UV – VIS [9].
Xử lý mẫu:
Lấy 10 ml mẫu vào bình có nút 100 ml
Thêm 5 ml K2S2O8 (4 g K2S2O8 trong 100 ml nước)
Thêm 1 ml H2SO4 30%
Đun ở 120oC trong 30 phút
Sau đó chuyển tồn bộ mẫu đã đun vào trong bình định mức tới 50 ml bằng
nước cất. Lấy 10 ml mẫu này cho vào bình định mức 50 ml
Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút Đo mẫu tại bước sóng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. Tính tốn kết quả
C= Cđo 50/10 50/10 (mg/l)
Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.8.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Ortho photphate (PO43-)
Lấy 10 ml mẫu cho vào bình định mức 50 ml
Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6
Định mức tới 50 ml bằng nước cất.
Đo tại bước sóng 710 nm
Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả. C= Cđo 50/10 (mg/l)
Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)
Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).
2.3.9. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA
Các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý nitơ và photpho được phân tích trình tự gen 16S rRNA để xác định cây phân loại.
Trình tự gen đoạn 16S rRNA được đọc trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA được so sánh với trình tự đoạn gen tương tưng của các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X.
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phần mềm njplot.
2.3.10. Phương pháp thống kê sinh học
Các kết quả thu được được xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phần mềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. 1. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ.
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ và có khả năng hình thành màng sinh học hình thành màng sinh học
3.1.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ
Các mẫu sau khi đưa về phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành phân tích hàm lượng nitơ và photpho ban đầu có trong các mẫu. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1. Hàm lượng thành phần nitơ và photpho trong mẫu phân tích.
Mẫu
Hàm lượng các hợp chất nitơ trong mẫu phân lập (mg/l) Hàm lượng photpho tổng (mg/l) Nitơ tổng NH4+ NO2- 1 140,74 ± 2,1 71,58 ± 1,43 5,31 ± 0,032 16,97 ± 1,02 2 111,93 ± 1,68 78,42 ± 2,35 1,44 ± 0,009 18,76 ± 1,13 3 83,12 ± 1,25 68,26 ± 1,36 1,01 ± 0,006 46,05 ± 2,76 4 71,60 ± 0,71 65,14 ± 1,30 2,59 ± 0,016 10,68 ± 0,64 5 100,41 ±1,50 75,10 ± 1,50 7,33 ± 0,044 31,33 ± 1,88
Kết quả phân tích mẫu ban đầu cho thấy, các mẫu ban đầu đều có hàm lượng nitơ và photpho cao hơn nhiều so với mức trung bình và quy định cho phép đối với nước thải (Bảng 3.1).
Từ những mẫu thu được, chúng tôi đã phân lập được 65 chủng vi sinh vật có khả năng phát triển trên mơi trường Winogradsky. Trong đó, 41 chủng có khả năng phát triển trên mơi trường Winogradsky 1, 24 chủng có khả năng phát triển trên mơi trường Winogradsky 2. Kết quả phân lập ở bảng 3.2 cho thấy trên hai môi trường Winogradsky phân lập được các chủng từ nước thải bể biogas nhiều hơn so với các mẫu lấy ở khu tập trung rác thải. Số lượng các chủng thu được ở tầng giữa bể biogas đang sử dụng và đã không sử dụng nhiều hơn ở tầng đáy bể biogas đã ngưng sử dụng. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu cho rằng các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa NH4+ và NO2- là những vi khuẩn hiếu khí [69], [71].
Bảng 3.2. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ
Địa điểm lấy mẫu
Số chủng phân lập Ký hiệu chủng Môi trường W1 Môi trường W2 Nước thải bể biogas Tầng giữa bể biogas đã ngưng sử dụng 11 15 Từ B11.1 đến B11.11 Từ B21.1 đến B21.15 Tầng đáy bể biogas đã ngưng sử dụng 4 0 Từ B12.1 đến B12.4 Tầng giữa bể biogas đang sử dụng 13 9 Từ B13.1 đến B13.13 Từ B23.1 đến B23.9 Nước thải khu tập trung rác thải Ngoài bãi rác 5 0 VP1.1, VP1.4, VP1.5, VP1.8, VP1.9, Trong bãi rác 8 0 VP2.2, VP2.3, VP2.4, VP2.5, VP2.7, VP2.9, VP2.10, VP2.11 Các chủng phân lập trên môi trường Winogradsky 1 (Hình 3.1A) có đặc điểm chủ yếu là khuẩn lạc tế bào trịn hay có hình tia, có màu trắng đục hay vàng. Các chủng phân lập trên môi trường Winogradsky 2 khuẩn lạc chủ yếu giống trên mơi trường Winogradsky 1, có hình tia hay trịn, màu trắng đục (Hình 3.1B).
Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập trên môi trường Winogradsky 1(A) và
3.1.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập
Bằng phương pháp nhuộm với tím kết tinh bước đầu đã chúng tơi đánh giá được khả năng hình thành màng sinh học của 28 chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường Winograky 1 từ mẫu nước thải ở bể biogas. Kết quả cho thấy hầu hết các vi khuẩn phân lập được đều có khả năng hình thành biofilm, trong đó các chủng B11.8, B11.11 và B13.1 có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất với số OD đo ở bước sóng 570 nm lần lượt tương ứng là 1,824; 2,775 và 2,235 (Hình 3.2).
Hình 3.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải thu từ bể biogas
Khi tiến hành đánh giá 13 mẫu thu được ở khu tập trung rác thải Vạn Phúc bằng phương pháp tương tự, chúng tôi thu được hai chủng VP1.1 và VP2.11 là hai chủng có chỉ số OD đo ở bước sóng 570 nm cao hơn các chủng cịn lại với số đọc tưng ứng là 4,65 và 3,24 (Hình 3.3).
Từ những kết quả thu được như trên, chúng tôi đã tuyển chọn được 5 chủng có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất và có khả năng phát triển trên môi trường Winogradsky 1 là : VP1.1, VP2.11, B11.8, B11.11, B13.1.
Hình 3.3. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải khu tập trung rác thải
Hình 3.4. Khả năng tạo hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 2 được phân lập ở bể biogas
Đối với các chủng phân lập được trên môi trường Winogradsky 2, chúng tơi cũng tiến hành các thí nghiệm tương tự để đánh giá khả năng hình thành biofilm. Kết quả cho thấy, trong 24 chủng thu được, 3 chủng B21.1, B21.10 và B23.2 có khả
năng tạo màng biofilm tốt nhất. Chúng tôi lựa chọn 3 chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo để phân tích khả năng chuyển hóa NO2- (Hình 3.4).
3.1.2. Khả năng chuyển hóa nitơ
8 chủng vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất được chúng tơi chọn để thử hoạt tính chuyển hóa các hợp chất nitơ. Trong đó 5 chủng B11.8, B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được thử khả năng chuyển hóa amoni, 3 chủng B21.1, B21.10 và B23.2 được thử khả năng chuyển hóa nitrite.
3.1.2.1. Khả năng chuyển hóa amoni
Khả năng chuyển hóa amoni được đánh giá thơng qua hàm lượng NH4+ trong mẫu nghiên cứu theo thời gian. Chủng vi sinh vật nào có khả năng chuyển hóa amoni thì hàm lượng NH4+ sẽ giảm đi trong quá trình nghiên cứu. 5 chủng B11.8, B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được nuôi lắc trong môi trường Winogradsky 1, sau mỗi khoảng thời gian nghiên cứu, lấy mẫu phân tích.
Hình 3.5. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng nghiên cứu.
Với hàm lượng amoni trong mẫu ban đẫu là 450 mg/l. Kết quả (Hình 3.5) cho thấy, sau 5 ngày, bốn chủng B11.8, B13.1, VP1.1 và VP2.11 nồng độ NH4+ giảm đi khơng nhiều, trong khi đó, với chủng B11.11, nồng độ NH4+ giảm 58,93% so với mẫu ban đầu. Nồng độ NH4+ tiếp tục giảm đi, sau 10, 15 ngày, hàm lượng trong mẫu của chủng B11.8 giảm đi 12,2%, B13.1 giảm đi 28,53%, VP1.1 giảm đi
14,44% và VP2.11 giảm đi 10,52%. Sau 20 ngày, chủng B11.11 hàm lượng NH4+ có trong mẫu đã giảm đi 85,21%. Trong khi đó, 4 chủng còn lại hàm lượng NH4+ trong dung dịch chỉ giảm đi vào khoảng từ 20-50% so với mẫu ban đầu. Từ kết quả trên cho thấy chủng B11.11 có khả năng chuyển hóa amoni tốt nhất. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn chủng B11.11 cho các nghiên cứu tiếp theo của mình.
3.1.2.2. Khả năng chuyển hóa nitrite
Với các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường Winogradsky 2, chúng tôi cũng tiến hành các thí nghiệm tương tự. Khả năng chuyển hóa nitrite được đánh giá thơng qua hàm lượng NO2- giảm theo thời gian nghiên cứu. 3 chủng B21.1, B21.10, B23.2 được nuôi lắc trong môi trường Winogradsky 2.
Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng nghiên cứu
Với hàm lượng nitrite trong mẫu ban đầu là 80 mg/l. Kết quả hình 3.6 cho thấy cả ba chủng nghiên cứu đều có khả năng chuyển hóa nitrite, sau 5 ngày, nồng độ NO2- trong dịch nuôi lắc của chủng B21.10 giảm đi 75.23% so với mẫu ban đầu, tương ứng, hai chủng B23.2 và B21.1 là 69.07% và 7.26%. Chủng B21.1 có khả năng chuyển hóa NO2- nhưng khả năng chuyển hóa chậm hơn, sau 20 ngày hàm lượng NO2- trong dung dịch giảm đi 75% so với mẫu ban đầu trong khi hai chủng B21.10 và B23.2 đã chuyển hóa gần như hồn toàn lượng NO2- có trong mẫu lắc.
Kết quả, sau 20 ngày hai chủng B21.10 và B23.2 đã chuyển hóa được trên 97% lượng NO2- có trong mẫu. Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn ra hai chủng B21.10 và B23.2 cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
3. 2. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho.
3.2.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho và có khả năng hình thành màng sinh học.
3.2.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho
Mẫu nước thải từ bể biogas và nước thải khu xử lý rác thải khi phân lập trên môi trường AMM thu được các khuẩn lạc chủ yếu màu trắng đục, hơi vàng, khuẩn lạc trịn (Hình 3.7). Dựa vào kích thước, màu sắc và hình dạng, chúng tơi đã thu được 21 chủng với ký hiệu như bảng 3.3.
Hình 3.7. Một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường AMM: mẫu khu vực biogas
(A) và khu tập trung rác thải (B)
Kết quả phân lập ở bảng 3.3 cho thấy, câc chủng phân lập ở tầng giữa bể biogas cao hơn so với tầng đáy, trong khu vực tập trung rác thải cao hơn so với bên ngoài khu vực.
Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho Địa điểm thu mẫu Mẫu thu được Ký hiệu Địa điểm thu mẫu Mẫu thu được Ký hiệu
Nước thải từ bể biogas 13 chủng
Từ A1.1 dến A1.8 Từ A2.1 đến A2.2 Từ A3.1 đến A3.3 Nước thải từ khu tập trung
rác thải 8 chủng
Từ A4.1 đến A4.3 Từ A5.1 đến A5.5
3.2.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập
Tiến hành các thí nghiệm tương tự về xác định khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập từ mơi trường AMM. Kết quả trên hình cho thấy, chủng A4.2, A5.1, A5.2, A5.3 là bốn chủng có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất (Hình 3.8). Do vậy chúng tôi đã lựa chọn 4 chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.8. Khả năng hình thàng màng sinh học của các chủng vi sinh vật có khả
3.2.2. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu.
Đánh giá khả năng giảm hàm lượng photpho, chúng tôi đánh giá thông qua hàm lượng photphate tích lũy trong vi sinh vật. Chúng tơi tiến hành nuôi cấy lắc các chủng nghiên cứu trong môi trường AMM trong thời gian 10 ngày ở các điều kiện tối ưu về pH và nhiệt độ. Để đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật, chúng tơi phân tích, đánh giá thơng qua hàm lượng photphate cịn lại trong mơi trường.
Hình 3.9. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường với
hàm lượng photpho 6mg/l
Kết quả hình 3.9 cho thấy, với hàm lượng photpho trong dung dịch AMM ban đầu là 6mg/l, các chủng vi sinh vật đều có khả năng tích lũy photpho, sau 10 ngày, lượng photpho trong dung dịch nuôi lắc gần như khơng cịn được phát hiện. Các chủng A5.1, A5.2 và A5.3 sau 5 ngày đã khơng cịn phát hiện thấy photphate có trong dung dịch ni cấy, tương ứng với chủng A4.2 là 7 ngày.