Kết quả thử khả năng hình thành màng sinh học ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (Hình 3.15) cho thấy, hai chủng B11.11 và B21.10 có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ là 37oC, chủng B23.2 có khả năng hình thành màng sinh học tốt trong dải nhiệt độ khá rộng từ 37 đến 50oC, điều kiện nhiệt độ tốt nhất cho sự hình thành màng sinh học của chủng A4.2 là 50oC.
Khi nghiên cứu các điều kiện cho vi sinh vật phát triển thì một trong những yếu tố được quan tâm là giá trị pH. Ở các pH khác nhau, mức độ sinh trưởng của vi sinh vật cũng rất khác nhau và điều này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và hình thành màng sinh học của bản thân chúng. Vi sinh vật chỉ có thể phát triển trongmột khoảng pH nhất định, khi pH mơi trường nằm ngồi khoảng cho phép, vi sinh vật sẽ phát triển yếu đi hoặc có thể bị ức chế hồn tồn. Các chủng vi sinh vật khác nhau có khoảng pH phát triển khác nhau do đó ảnh hưởng tới khả năng tạo màng sinh học.
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH mơi trường lên khả năng hình thành màng sinh học
Kết quả thử khả năng tạo màng của các chủng nghiên cứu cho thấy, hầu hết các chủng đều có khả năng tạo màng sinh học tốt ở điều kiện pH kiềm khoảng 7,5, chủng A4.2 có khả năng tạo màng tốt ở pH 7, chủng B21.10 có khả năng tạo màng sinh học tốt ở pH 8 (Hình 3.16). Theo nghiên cứu của Wulff và cộng sự [65] đối với sự phát triển và hình thành màng sinh học của vi khuẩn Xylella fastidiosa nhận thấy
rằng sự hình thành màng sinh học chịu ảnh hưởng lớn của giá trị pH, với vi khuẩn này, khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất ở pH 6.8, và bị ức chế hình thành màng ở pH dưới 6.6. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu, các chủng phân lập từ nước thải bể biogas và khu tập trung xử lý rác thải thường phát triển tốt ở pH trong khoảng từ 7 đến 8.5 [10].
3.3.4. Khả năng chuyển hóa một số chất trong bộ kit APi
Để nghiên cứu một số tính chất về mặt sinh hóa, chúng tơi đã sử dụng kit thử APi. Các chất trong bộ kit dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các vi sinh vật là các nguồn cacbon khác nhau (D-glucose, L-arabinose, D- mannose, D- mannitol, N- acetyl- glucosamine…), urea, L-tryptophan, L-arginine, gelatine…Kết quả được trình bày ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh hoá của các chủng theo kit APi (BioMérieus)
Ký hiệu chất kiểm tra
Các chất chuyển hóa
Các chủng vi sinh vật nghiên cứu B11.11 B21.10 B23.2 A4.2
NO3 KNO3 + + + +
TRP L- tryptophan - - - -
ADH L- arginine + - + +
URE Urea - - + -
ESC Esculin ferric citrate + + + +
GEL Gelatine + + - + PNPG 4-nitrophenyl β D – galactopyranoside + + + + GLU D- glucose + + + + ARA L- arabinose - + - + MNE D- mannose + + + +
Chú thích (-): phản ứng âm tính, (+) phản ứng dương tính
Với kí hiệu dấu (-) biểu thị cho phản ứng âm tính, dấu (+) biểu thị cho phản ứng dương tính với sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ. Kết quả cho thấy, các chủng B11.11, B21.1, B23.2 và A4.2 có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau, đặc biệt chủng A4.2 và B23.2 có khả năng sử dụng hầu hết các loại đường, chủng B11.11 khơng có khả năng sử dụng L – arabinose, chủng B21.10 không sử dụng được L – arabinose, N – acetyl – glucosamine và D – mantose (Bảng 3.4). Khi tiến hành phân tích trên phần mềm của BioMérieus, chủng B23.2 có khả năng thuộc chi
Pseudomonas.
Với khả năng sử dụng các loại đường khác nhau, các chủng vi sinh vật này có khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon thay thế khác nhau, việc thay thế nguồn cacbon từ vật liệu có chi phí và giá thành cao sang có chi phí phù hợp sẽ giúp cho quá trình đưa sản phẩm vào ứng dụng rộng rãi hơn. Các chủng nghiên cứu xử lý nước thải có chứa nitơ đều có khả năng khử NO3- cho thấy phù hợp với nghiên cứu, chủng A4.2 là chủng có khả năng xử lý photpho, tuy nhiên, kết quả trên bảng cho thấy, chủng này cũng có khả năng khử NO3-, theo nghiên cứu của Jorgensen và Pauli cho rằng các chủng có khả năng tích lũy photphate cũng có khả năng chuyển hóa nitơ [33].
MAN D- mannitol + + + +
NAG N- acetyl- glucosamine + + - +
MAL D- mantose + + - +
GNT Potassium gluconate - - + +
CAP Axit capric - - + -
ADI Axit Adipic - - - -
MLT Axit Malic + - + +
CIT Trisodium Citrate - - + +
3.3.5. Trình tự 16S rRNA và cây phát sinh chủng loại
Chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S rARN. Kết quả giải trình tự gen 16S rARN được so sánh với các trình tự gen 16S rARN trong ngân hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trên cơ sở đó, chúng tơi xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa vào phần mềm njplot
Trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng B11.11 tương đồng 99,9 % (1399/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,6 % (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN
của vi khuẩn Bacillus sonorensis_AF302118; tương đồng 99,4 % (1391/1400 bp) với đoạn 16S rARN của vi khuẩn Bacillus aerius_AJ831843 (Hình 3.17). Theo
nghiên cứu của Kim và cộng sự, cùng với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và
Bacillus cereus, Bacillus licheniformis là một trong các chủng thuộc chi Bacillus có
khả năng nitrate hóa và khử nitrate trong điều kiện hiếu khí, và lượng amoni đã chuyển sang khí N2 là 33% sau 4 giờ ni cấy [34].
Hình 3.17. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B11.11
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus altitudinis_AJ831842 99 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus safensis_AF234854 99 100 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 B11.11 100 Bacillus sonorensis_AF302118 63 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus siamensis_GQ281299 Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 Bacillus methylotrophicus_EU194897 57 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus mojavensis_AB021191 Bacillus subtilis_AB042061
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF
54 78 88 52 81 100 97 100 99 0.01
Hình 3.18. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B21.10
Kết quả giải trình tự gen 16S rARN của chủng B21.10 tương đồng 99,8% (1397/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 và Bacillus methylotrophicus_EU194897; tương
đồng 99,6% (1395/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus vallismortis_AB021198; tương đồng 99,6% (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S
rARN của vi khuẩn Bacillus siamensis_GQ281299 (Hình 3.18). Trong nghiên cứu của Zhang cùng cộng sự, Bacillus methylotrophicus có khả năng chuyển hóa cả
NH4+ và NO2- thành khí N2O với hiệu suất tương ứng là 51,58 và 5,81 mg/l/ngày [68].
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus altitudinis_AJ831842 99 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus safensis_AF234854 99 100 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus mojavensis_AB021191
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970 Bacillus subtilis_AB042061 77 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 Bacillus siamensis_GQ281299 Bacillus methylotrophicus_EU194897 B21.10 50 80 89 79 68 80 100 97 100 99 0.01
Hình 3.19. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B23.2
Kết quả giải rình tự gen 16S rARN của chủng B23.2 tương đồng 97,8% (1370/1401 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes_Z76666; tương đồng 97,6% (1368/1401 bp) với đoạn gen 16S
rARN của vi khuẩn Pseudomonas mendocina_D84016 (Hình 3.19). Kết quả này
cho thấy, chủng B23.2 có thể thuộc chi Pseudomonas. Đây là kết quả được công bố đầu tiên về vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes có khả năng chuyển hóa nitrite trong môi trường so với nghiên cứu của Zhang và cộng sự về khả năng chuyển hóa của chủng Pseudomonas stutzeri có khả năng chuyển hóa nitrite [67].
Azorhizophilus paspali_AJ308318 Azotobacter beijerinckii_AJ308319 Azotobacter chroococcum_AB175653 Pseudomonas aeruginosa_X06684 Pseudomonas otitidis_AY953147 Pseudomonas resinovorans_Z76668 73 Serpens flexibilis_GU269546 Pseudomonas tuomuerensis_DQ868767 Pseudomonas stutzeri_AF094748 Pseudomonas xanthomarina_AB176954 Pseudomonas oleovorans subsp. lubricanti_DQ842018 Pseudomonas alcalophila_AB030583 Pseudomonas pseudoalcaligenes_Z76666 100 Pseudomonas mendocina_D84016 B23.2 66 76 71 50 100 57 92 68 93 89 0.01
.
Hình 3.20. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng A4.2
Trình tự gen 16S rARN của chủng A4.2 tương đồng 99.9% (1411/1413 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416 khi so sánh với các trình tự gen 16S rARN của các vi sinh vật trong ngân hàng gen quốc tế (Hình 3.20). Điều này cho chúng tôi kết luận: chủng A4.2 thuộc chi Bacillus. Đây là công bố đầu tiên ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis có khả năng xử lý photpho trong nước thải bằng việc tích lũy vào cơ thể vi sinh vật, một phần cung cấp năng lượng cho các q trình sinh hóa và trao đổi chất.
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 100 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus stratosphericus_AJ831841 99 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 99 97 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 A4.2 100 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus mojavensis_AB021191 59 Bacillus subtilis_AB042061 77 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus nematotocita_AY820954 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus siamensis_GQ281299
Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 Bacillus methylotrophicus_EU194897 6866 62 81 59 71 100 100 100 99 68 89 0.01
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và được 65 chủng vi sinh vật trên môi trường Winogradsky và 21 chủng trên môi trường AMM từ các mẫu nước thải ở Thanh Hóa và Hà Nội.
2. Đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học và có khả năng xử lý nitơ và photpho tốt nhất là các chủng có ký hiệu B11.11, B21.10, B23.2 và A4.2. Các chủng có khả năng hình thành màng sinh học ở nhiệt độ trong khoảng từ 37 đến 50oC, pH từ 7 đến 8.
3. Đã phân loại và xác định được 3 chủng có khả năng xử lý nitơ tốt nhất, trong đó, chủng B11.11 có khả năng chuyển hóa 85.21% NH4+ sau 20 ngày nuôi cấy, chủng B21.10 chuyển hóa 97,28% và B23.2 chuyển hóa 97,14% lượng NO2- sau 20 ngày nuôi cấy.
4. Đã phân loại và xác định được chủng A4.2 có khả năng xử lý photpho tốt nhất, sau 10 ngày, hàm lượng photpho trong môi trường giảm đi 39.32% tương ứng với mơi trường có hàm lượng photpho là 18 mg/l.
5. Dựa trên trình tự gen 16S rARN, đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, chủng B11.11 và A4.2 được xác định gần với loài Bacillus licheniformis, chủng B21.10 được xác định gần với loài Bacillus amyloliquefaciens,
chủng B23.2 xác định gần với loài Pseudomonas pseudoalcaligenes.
KIẾN NGHỊ
1. Thay đổi hàm lượng nitơ và photpho phù hợp với nghiên cứu. Kiểm tra khả năng chuyển hóa các chất trong mơi trường và sự hình thành màng sinh học khi thay đổi hàm lượng.
2. Nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện chuyển hóa các hợp chất nitơ và photpho, nghiên cứu và lựa chọn giá thể, chất mang phù hợp cho sự hình thành màng sinh học của các chủng nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Kiểu Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học, phần 1, NXB Đại học
Quốc Gia Hà Nội
2. Bộ Tài Nguyên và Môi trường (2010), Báo cáo môi trường Quốc gia 2010, Hà Nội.
3. Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ và photpho, NXB
Khoa học tự nhiên và Công nghệ.
4. Lương Đức Phẩm (2003), Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học, NXB Giáo dục.
5. Nguyễn Hoài Hương (2009), Giáo trình thực hành vi sinh ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TPHCM.
6. Nguyễn Văn Phước (2007), Xử lý nước thải sinh hoạt và công nghiệp bằng
phương pháp sinh học, NXB Xây dựng.
Tiếng Anh
7. Anderson I.C., Poth M., Homstead J., and Burdige D. (1993), “A comparison of NO and N2O production by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (11), pp. 3525-3533.
8. Annachhatre A.P. and Bhamidimarri S.M.R. (1992), “Microbial attachment and growth in fixed-film reactors: Process startup considerations”,
Biotechnology Advances, 10 (1), pp. 69-91.
9. APHA (2001), Standard Methods for the Examination of Water and Wastewate., 20th edition, American Public Health Association, Washington,
DC.
10. Asgari M.J., Safavi K., and Mortazaeinezahad F. (2011), “Landfill biogas production process”, International Conference on Food Engineering and Biotechnology, 9, pp. 208-212
11. Bao L.-L., Li D., Li X.K., Huang R.X., Zhang J., Yang L., and Xia G.Q. (2007), “Phosphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous- flow two-sludge system”, Journal of Environmental Sciences, 19 (4), pp.
391-395.
12. Bernet N., Dangcong P., Delgenès J., and Moletta R. (2001), “Nitrification at low oxygen concentration in biofilm reactor”, Journal of Environmental Engineering, 127 (3), pp. 266-271.
13. Boelee N.C., Temmink H., Janssen M., Buisman C.J.N., and Wijffels R.H. (2011), “Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater effluent using microalgal biofilms”, Water Research, 45 (18), pp. 5925-5933. 14. Boyd C.E. and Tucker C.S. (1998), Pond Aquaculture Water Quality
Management, Kluwer Acad. Publ.
15. Broda E. (1977), “Two kinds of lithotrophs missing in nature”, Zeitschrift für
allgemeine Mikrobiologie, 17 (6), pp. 491-493.
16. Cheung K.C., Chu L.M., and Wong M.H. (1997), “Ammonia stripping as a pretreatment for landfill leachate”, Water, Air, and Soil Pollution, 94 (1-2),
pp. 209-221.
17. Cong L.T.N., Huyen H.T., and Minh N.N. (2012), “Phenol degradation of biofilm formed by mixing - marine bacteria”, VNU. Journal of Science, 28
(2S), pp. 75-81.
18. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin- Scott H.M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49, pp. 711-745.
19. Czaczyk K. and Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal
of Environmental Studies, 16 (6), pp. 799-806.
20. Di Bonaventura G., Stepanovic S., Picciani C., Pompilio A., and Piccolomini R. (2007), “Effect of environmental factors on biofilm formation by clinical
Stenotrophomonas maltophilia isolates”, Folia Microbiologica., 52 (1), pp.
86-90.
21. Donlan R.M. (2002), “Biofilms: microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases Journal, 8 (9), pp. 881-890.
22. Federation W.E. (1998), Biological and chemical systems for nutrient removal, Water Environment Federation, Alexandria, VA.
23. Flemming H.-C. (1993), “Biofilms and Environmental Protection”, Water Science & Technology, 27 (7-8), pp. 1-10.
24. Giaouris E., Chorianopoulos N., and Nychas G.J.E. (2005), “Effect of temperature, pH, and water activity on biofilm formation by Salmonella enterica enteritidis PT4 on stainless steel surfaces as indicated by the bead vortexing method and conductance measurements”, Journal of Food Protection, 68 (10), pp. 2149-2154.
25. Gilbert P., Das J., and Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”, Advances in Dental Research, 11 (1), pp. 160-167.
26. Hang T.T. and Huy N.Q. (2011), “Isolate biofilm forming Bacillus strains
from contamination site in trade villages in Viet Nam”, VNU. Journal of Science, 27 (2S), pp. 157-162.
27. Henze M., Harremoes P., Jansen J.C., and Arvin E. (2001), Wastewater Treatment: Biological and Chemical Processes, Springer.
28. Heydorn A., Nielsen A.T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll B.K., and Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT”, Microbiology (Reading, England), 146
(10), pp. 2395-2407.
29. Ho K.L., Pometto A.L., and Hinz P.N. (1997), “Optimization of L-(+)-lactic acid production by ring and disc plastic composite supports through repeated-batch biofilm fermentation”, Applied and Environmental Microbiology, 63 (7), pp. 2533-2542.
30. Hoilijoki T.H., Kettunen R.H., and Rintala J.A. (2000), “Nitrification of anaerobically pretreated municipal landfill leachate at low temperature”,
Water Research, 34 (5), pp. 1435-1446.
31. Hunik J.H., Van Den Hoogen M.P., De Boer W., Smit M., and Tramper J. (1993), “Quantitative determination of the spatial distribution of
Nitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis cells immobilized in kappa-
carrageenan gel beads by a specific Ffuorescent-antibody labelling technique”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (6), pp. 1951-
1954.
32. Huy N.Q., Lien N.T.P., and Hang T.T. (2011), “Characterization of biofilm- forming bacteria isolated from soil in Viet Nam”, VNU. Journal of Science, 27 (2S), pp. 187-193.
33. Jørgensen K.S. and Pauli A.S.L. (1995), “Polyphosphate accumulation among denitrifying bacteria in activated sludge”, Anaerobe, 1 (3), pp. 161-
168.
34. Kim J.K., Park K.J., Cho K.S., Nam S.-W., Park T.-J., and Bajpai R. (2005), “Aerobic nitrification–denitrification by heterotrophic Bacillus strains”, Bioresource Technology, 96 (17), pp. 1897-1906.
35. Kokare C.R.C., Khopade A.N., and Mahadik K. (2009), “Biofilm : importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 18, pp. 159- 168.
36. Lacko N., Drysdale G.D., and Bux F. (2003), “Anoxic phosphorus removal by denitrifying heterotrophic bacteria”, Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research, 47
(11), pp. 17-22.
37. Lazarova V. and Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29 (10), pp.
38. Li X.Z., Zhao Q.L., and Hao X.D. (1999), “Ammonium removal from landfill leachate by chemical precipitation”, Waste Management, 19 (6), pp.
409-415.
39. Lopez D., Vlamakis H., and Kolter R. (2010), “Biofilms”, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2 (7), pp. a000398.
40. Monroe D. (2007), “Looking for chinks in the armor of bacterial biofilms”,
PLoS Biology, 5 (11).
41. Mulder A. (2003), “The quest for sustainable nitrogen removal technologies”, Water science and technology : a journal of the International