Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN

2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu 2.1.1.

Luận văn đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu xác định hàm lƣợng polyphosphat (bao gồm pyrophosphat và tripolyphosphat) trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D).

Nội dung nghiên cứu 2.1.2.

Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu của đề tài, các nội dung đƣợc thực hiện bao gồm:

 Tổng quan các tài liệu về phụ gia thực phẩm, đặc biệt là polyphosphat

(pyrophosphat, tripolyphosphat) và các phƣơng pháp xác định nhóm phụ gia này trong thực phẩm.

 Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quy trình xác định đồng thời

pyrophosphat và tripolyphosphat bằng phƣơng pháp CE-C4D

- Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ đệm khác nhau.

- Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu,…

- Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hƣởng đến việc xác định các chất phân tích trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C4D

 Khảo sát quy trình xử lý mẫu xác định polyphosphat trong thực phẩm.  Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu

- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn.

- Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp. - Đánh giá độ chụm, độ đúng của phƣơng pháp phân tích.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu phân tích 2.2.1.

 Thu thập mẫu

Các mẫu phân tích đƣợc thu thập ngẫu nhiên tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn thành phố Hà Nội và Quy Nhơn.

 Xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu

Mẫu phân tích đƣợc đồng nhất bằng cách cắt nhỏ, xay nhuyễn bằng máy xay. Mẫu sau khi đồng nhất đƣợc bảo quản trong trong túi đựng mẫu trong ngăn đá tủ lạnh (nhiệt độ < 0oC) cho đến khi phân tích. Đối với các loại thực phẩm nhƣ đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hƣ hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phịng cho đến khi phân tích.

 Xử lý mẫu trƣớc khi phân tích  Mẫu dạng lỏng (mẫu sữa)

Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu trƣớc đây, mẫu dạng lỏng, cụ thể là mẫu sữa đƣợc phân tích theo quy trình xử lý mẫu Hình 2.1. dƣới đây.

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dạng lỏng

 Mẫu dạng rắn

Các mẫu dạng rắn (nhƣ giị, chả, xúc xích, ba tê,…) đƣợc xử lý theo quy trình tối ƣu sau khi nghiên cứu, khảo sát theo phƣơng pháp đƣợc trình bày trong

Hút chính xác 5,0 mL mẫu vào ống fancol 15mL

Lắc đều, ngâm trong nƣớc sôi 15 phút

Phân tích điện di

Lọc qua giấy lọc băng xanh sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm Thêm 5,0 mL nƣớc deion

Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết 2.2.2.

nối kiểu tụ điện (CE-C4D)

Nguyên tắc: Hai chất phân tích tripolyphosphat và pyrophosphat, trong điều kiện môi trƣờng pH> pKa, chúng tồn tại ở dạng anion do đó có khả năng di chuyển từ đầu mao quản bơm mẫu (áp điện thế phân cực âm) đi qua vị trí đặt detector dƣới tác dụng của lực điện trƣờng và đƣợc ghi nhận tín hiệu phụ thuộc vào sự chênh lệch độ dẫn của chất phân tích với dung dịch đệm (chất nền điện ly). Mỗi ion chất phân tích có điện tích và kích thƣớc khác nhau dẫn tới độ linh động điện di khác nhau. Đó là cơ sở cho q trình phân tách, định tính cũng nhƣ định lƣợng đồng thời hai ion chất phân tích trong cùng một hỗn hợp dung dịch.

Chất phân tích đƣợc định tính bằng thời gian di chuyển và nguyên tắc của việc định lƣợng dựa trên cơ sở mối quan hệ tín hiệu đo của chất phân tích và nồng độ Cx của nó theo biểu thức:

H = k. Cx hoặc A = k. Cx Trong đó: H là chiều cao, A là diện tích pic điện di của chất phân tích.

Để xác định hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu ta có thể sử dụng phƣơng pháp đƣờng chuẩn hoặc thêm chuẩn dựa trên cơ sở của sự phụ thuộc tuyến tính trên.

Phương pháp khảo sát, tối ưu điều kiện phân tích điện di 2.2.3.

Trong phƣơng pháp điện di mao quản, có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hƣởng đến kết quả của q trình phân tích bao gồm: thành phần và pH của dung dịch đệm điện di; nồng độ dung dịch đệm, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu, thế tách, đƣờng kính trong và chiều dài hiệu dụng của mao quản. Các điều này sẽ đƣợc khảo sát một cách hệ thống, theo phƣơng pháp đơn biến (biến thiên một yếu tố tại một thời điểm).

 Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần, pH và nồng độ đệm

Đây là các yếu tố quan trọng nhất, quyết định đến dạng tồn tại của chất phân tích và ảnh hƣởng đến tính chất của các quá trình xảy ra trong mao quản, từ đó quyết định hiệu quả của q trình phân tích điện di. Để đạt đƣợc kết quả phân tích tốt nhất, các hệ dung dịch đệm bao gồm: L-Arginin/acetic, L-Arginin/ascorbic, L-

Histidin/acetic, L-Histidin/ascorbic đƣợc lựa chọn nghiên cứu với các giá trị pH cách nhau 0,5 đơn vị, nằm trong khoảng 4,0 đến 7,0. Sau khi lựa chọn đƣợc thành phần dung dịch và pH dung dịch đệm phù hợp nhất, nồng độ của hợp phần bazơ sẽ đƣợc khảo sát tai các giá trị: 7,0; 10,0; 15,0; 20,0 mM.

 Khảo sát thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu

Cùng với dung dịch đệm, một số yếu tố khác cũng đƣợc nghiên cứu, khảo sát tại các giá trị khác nhau, cụ thể: chiều cao bơm mẫu (10cm, 15cm, 20cm); thời gian bơm mẫu (20s; 30s; 40s), thế tách (-10kV; -15kV; -18kV; -20kV).

Phương pháp khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 2.2.4.

Mẫu thực phẩm (nhƣ giò, chả, xúc xích…) là một trong những nền mẫu tƣơng đối phức tạp, có chứa nhiều thành phần khác nhau nhƣ: lipid, protein, các chất phụ gia…[1]. Vì vậy, để đạt đƣợc hiệu quả phân tích tốt, một số kỹ thuật xử lý mẫu nhằm hạn chế ảnh hƣởng của protein và lipid đƣợc nghiên cứu chi tiết trên cơ sở các quy trình phân tích đƣợc mơ tả trong sơ đồ Hình 2.2. dƣới đây.

Tách loại chất béo bằng chiết lỏng lỏng hoặc thủy phân chất béo bằng

NaOH trong thời gian 30 phút Quy trình 2 Quy trình 1 Đơng tụ protein bằng TCA hoặc nƣớc nóng Cân ~2g mẫu

Rung siêu âm 20 phút

Ly tâm 20 phút ở tốc độ 8000 vòng/phút +10,0 mL H20 deion

Ly tâm 20 phút ở tốc độ 8000 vòng/phút

Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Các điều kiện xử lý mẫu cụ thể nhƣ loại dung môi chiết, nồng độ TCA, thời gian rung siêu âm,… đƣợc tối ƣu theo phƣơng pháp đơn biến.

Tất cả các quá trình khảo sát điều kiện xử lý mẫu đƣợc thực hiện song song giữa mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu giò lụa. Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn.

Đánh giá phương pháp phân tích 2.2.5.

2.2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích

 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích phát hiện đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Giới hạn phát hiện của TriP và PyroP đƣợc xác định bằng cách pha lỗng dần dung dịch chuẩn có nồng độ 50 ppm, phân tích trên thiết bị điện di mao quản đến khi xác định đƣợc nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trên nền nƣớc deion hoặc trên nền mẫu mà cho tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N) bằng 3. Khi nồng độ nhỏ nhất đó đƣợc xác định trên nền nƣớc deion thì thu đƣợc giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) cịn khi thí nghiệm tiến hành trên nền mẫu thì thu đƣợc giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL)

 Giới hạn định lƣợng (LOQ)

Thông thƣờng, giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10. Giới hạn định lƣợng của thiết bị (IQL) và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL) cũng đƣợc phân biệt và xác định tƣơng tự nhƣ IDL và MDL [6]. Ngoài ra, giá trị của LOQ cịn có thể đƣợc xem bằng 10/3 LOD.

2.2.5.2. Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại (độ chụm) của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%). Cơng thức tính SD và RSD% nhƣ sau:

SD = √∑( )

(2.1) RSD(%) =

×100 (2.2) Trong đó :

- Si là diện tích của pic điện di thứ i

- n là số lần phân tích lặp (n =6)

Các đại lƣợng này có thể đƣợc tính tốn trên phần mềm thống kê Minitab hoặc Origin.

Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích đƣợc xác định bằng cách tiến hành xử lý mẫu và phân tích lặp lại một số mẫu thực tế.

2.2.5.3. Độ đúng của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hoặc giá trị hiệu suất thu hồi xác định đƣợc sau khi thêm chuẩn [6].

Độ thu hồi (H): H ═

× 100 (2.3) Trong đó:

- H là hiệu suất thu hồi (%)

- Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích phân tích đƣợc

- Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào.

Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị ta có độ thu hồi của thiết bị.

Độ thu hồi của phƣơng pháp phân tích TriP và PyroP đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn một lƣợng chính xác chất phân tích vào nền mẫu giị khơng chứa hai chất phân tích này.

Tính tốn kết quả và uớc lượng độ khơng đảm bảo đo 2.2.6.

 Tính tốn kết quả

Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn và đƣợc tính tốn kết quả theo công thức 2.4 (với mẫu dạng lỏng), công thức 2.5 (với mẫu dạng rắn) dƣới dây.

Trong đó:

là hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu dạng lỏng (mg/l); là hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu dạng rắn (µg/g); là nồng độ thêm chuẩn (mg/l);

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo;

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo sau khi thêm chuẩn một lƣợng chính xác đã biết ;

K là hệ số pha loãng mẫu (hoặc dung dịch phân tích); H là hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu (%); m là khối lƣợng mẫu (g)

 Ước lượng độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo đƣợc xác định theo nguyên tắc của ISO GUM và EURACHEM [12].

 Xác định nguồn không đảm bảo đo

Các nguồn có liên quan đến độ khơng đảm bảo đo thành phần (cịn gọi là độ không đảm bảo chuẩn) đƣợc xác định và thể hiện trong hình 2.3.

Hình 2.3. Sơ đồ các nguồn khơng đảm bảo đo

 Xác định độ không đảm bảo thành phần

- Trong nghiên cứu này, với bình định mức cấp A 10 mL có dung sai ±0,2 mL (từ thông tin kỹ thuật đƣợc cung cấp), các giá trị phân bố

K Cmẫu ΔC S0; Sst H m Độ tinh khiết (P) Khối lƣợng chuẩn Độ chụm Độ chụm Độ chụm Thể tích (V) Độ chụm Thể tích Độ chụm Hiệu chuẩn Hiệu chuẩn Thể tích nƣớc Khối lƣợng mẫu

khơng giống nhau trên tồn khoảng chia, do đó, giả định phân bố hình tam giác thì độ khơng đảm bảo đo là

√

- Tƣơng tự, với bình định mức 25 mL cấp A có dung sai ±0,08 mL, độ không đảm bảo đo là

√

- Cân phân tích với khả năng đọc trong khoảng ±0,0001 g. Từ bảng phân bố chuẩn, với độ tin cậy 95%, độ không đảm bảo đƣợc tính là .

- Khi độ tinh khiết của chất chuẩn đƣợc chứng nhận có độ chính xác ±a, giả định phân bố hình chữ nhật, độ khơng đảm bảo

√

- Độ chụm (độ lặp lại): giá trị độ lệch chuẩn (SD) của q trình phân tích lặp lại có thể sử dụng trực tiếp làm độ không đảm bảo chuẩn. Độ không đảm bảo chuẩn đƣợc tính từ các giá trị độ không đảm bảo thành phần theo nguyên tắc tƣơng tự nhƣ lan truyền sai số.

 Tính tốn độ khơng đảm bảo chuẩn tổng hợp

Độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp đƣợc ƣớc lƣợng từ độ không đảm bảo chuẩn thành phần theo lan truyền độ khơng đảm bảo và đƣợc tính theo cơng thức 2.6.

√( ) ( ) ( ) (

) ( )

 Báo cáo kết quả với độ không đảm bảo đo mở rộng

Kết quả hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu (Cmẫu) đƣợc báo cáo dƣới dạng:

Với: U là độ không đảm bảo đo mở rộng đƣợc xác định từ độ không đảm bảo chuẩn tổng hợp với hệ số phủ k = 2 (ở độ tin cậy 95%), U = 2 .

2.3. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất 2.3.1.

- Natri pyrophosphat (Na4P2O7, Sigma, 95%)

 Các loại hóa chất khác

- L-Arginin (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lƣợng > 99,5%) - L - Histidin( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lƣợng 99,5%) - Natri hydroxyd (NaOH), (Merck, Đức)

- L-Ascorbic (Sigma, 99%)

- Acid clohydric (HCl) (Merck, Đức)

- Acid acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)

- Nƣớc nƣớc deion: là nƣớc cất hai lần đƣợc lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 μm.

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (P.A).

Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 2.3.2.

 Pha dung dịch chuẩn gốc Natri polyphosphat và Natri pyrophosphat 1000 ppm

Cân chính xác 0,0294g Natri tripolyphosphat hoặc 0,0263g Natri pyrophosphat, chuyển vào bình định mức 25,0 mL, thêm khoảng 15mL nƣớc deion, lắc đều đến khi tan hết chất rắn, sau đó định mức đến vạch bằng nƣớc deion.

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm đƣợc bảo quản trong chai PE ở nhiệt độ phòng trong vòng một tháng.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc bằng cách pha loãng với nƣớc deion.

 Pha dung dịch đệm

Các dung dịch đệm điện di Arg/ace; His/ace; và Arg/asc đƣợc pha bằng cách cân một lƣợng chính xác hợp phần bazơ là Arg hoặc His, chuyển vào bình định mức, thêm khoảng 15mL nƣớc deion, lắc đều cho chất rắn tan hết, định mức đến vạch. Sau đó, dung dịch đƣợc chỉnh đến pH cần thiết bằng acid acetic hoặc acid ascorbic.

Tất cả các dung dịch đều đƣợc rung siêu âm và chỉnh lại giá trị pH trƣớc khi sử dụng. Dung dịch đệm đƣợc pha mới hàng ngày.

Thiết bị dụng cụ 2.3.3.

 Thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C4D tự chế, bán tự động (Hình 2.4) đƣợc thiết kế lắp đặt với sự tài trợ của Cơng ty 3Sanalysis và đối tác tại khoa Hóa học, trƣờng Đại học Basel, Thụy Sĩ.

Hình 2.4. Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động

(1- Hộp thế an toàn; 2 - Bộ điều khiển thế ; 3- Cảm biến đo độ dẫn không tiếp

xúc (C4D); 4- Bộ phận kết nối bán tự động; 5- Núm điều chỉnh; 6- Bộ phận

điều khiển; 7- Bình khí nén)

 Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521

 Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH

chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.

 Cân phân tích của hãng Scientech (Mỹ), độ chính xác 0,1mg.  Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu.

 Dụng cụ

 Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh.

 Micropipet với các loại khỏc nhau: 2ữ20, 20ữ200 v 100ữ1000 àl vi cỏc

đầu cơn tƣơng ứng.

 Đầu lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45μm và 0,2µm.  Các xylanh lọc để lọc mẫu.

 Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 50cm, đƣờng kính trong

(ID) là 50 μm.

 Các ống fancol 15 và 50mL.

3. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện phân tích đồng thời tripolyphosphat và pyrophosphat bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn pyrophosphat bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D)

Hiệu quả của quá trình tách các chất phân tích bằng phƣơng pháp điện di