Dòng EOF di chuyển từ cực dƣơng sang cực âm. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngƣợc lại các anion di chuyển ngƣợc chiều với dịng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hịa khơng chịu tác động của điện trƣờng nên di chuyển cùng tốc độ với dịng EOF. Nhƣ vậy, dịng EOF đóng vai trị quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại chất tan ở trong ống mao quản. Do đó, phải lựa chọn các điều kiện điện di phù hợp nhất để có tốc độ dòng điện di phù hợp cho q trình phân tách tín hiệu của hỗn hợp các chất phân tích.
Dung dịch đệm điện di:
Dùng để tạo mơi trƣờng cho q trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản. Bản chất, thành phần, độ nhớt và giá trị pH của pha động điện di có ảnh hƣởng trực tiếp lên bề mặt mao quản từ đó ảnh hƣởng đến kết quả của q trình điện di. Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản đƣợc đƣợc đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di.
Nguồn điện thế cao:
Thƣờng dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh ra điện trƣờng lớn cho quá trình điện di xảy ra. Để phân tích các cation thì cực
áp cực dƣơng vào đầu bơm mẫu của mao quản và ngƣợc lại để phân tích các anion thì áp cực âm vào đầu bơm mẫu của mao quản.
Detector: bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau q trình điện di.
Tùy thuộc vào tính chất hóa học, hóa lý hay vật lý của các chất phân tích sẽ có các loại detector tƣơng ứng, bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, điện thế (đo dòng, đo thế, độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [4].
Trong đề tài này, detector đƣợc sử dụng là detector đo độ dẫn không tiếp xúc. Nguyên tắc của detetor đo độ dẫn là đo liên tục điện trở (trở kháng) của dung dịch bằng một mạch điện sử dụng dòng xoay chiều (AC). Detector này ngoài ƣu điểm là phân tích đa năng cịn có ƣu điểm là khơng nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hƣởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích.
Bộ phận điều khiển:
Thƣờng là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích. Hiện nay, bộ phận này cịn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hố q trình phân tích từ khâu bơm mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của q trình phân tích điện di mao quản.
Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE 1.6.2.
Mẫu phân tích đƣợc nạp vào mao quản bằng các kỹ thuật: thủy động lực học (dùng áp suất hoặc theo kiểu xiphông) và điện động học [3, 4].
+ Kỹ thuật bơm mẫu thủy động lực học dùng áp suất: Dùng một áp suất thích hợp để nén (đẩy) hoặc hút một lƣợng vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng lực của dòng điện với một điện thế cao (5- 10kV) thích hợp để đƣa mẫu phân tích vào mao quản trong một thời gian nhất định. + Kỹ thuật bơm mẫu thủy động lực học kiểu xiphông: Dựa trên sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản, chiều cao chênh lệch từ 10-30 cm trong khoảng thời gian từ vài giây đến vài phút tùy nồng độ chất phân tích.
Kỹ thuật bơm mẫu đƣợc sử dụng trong đề tài là thủy động lực học kiểu xiphơng. Kỹ thuật này có ƣu điểm là thao tác đơn giản, không cần sử dụng thiết bị phức tạp, độ lặp lại tƣơng đối tốt.
Kết luận chung:
Polyphosphat có nhiều ƣu điểm so với các chất phụ gia bảo quản khác và ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm. Tuy nhiên việc sử dụng hàm lƣợng quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển quy trình phân tích polyphosphat là cần thiết. Trong những năm gần đây, phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc đƣợc biết đến là một phƣơng pháp đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp, có tiềm năng trong việc triển khai tại các cơ sở phân tích địa phƣơng, phân tích tại hiện trƣờng. Vì vậy, đề tài này đƣợc thực hiện với hi vọng đóng góp một phần nhỏ vào việc phát triển các phƣơng pháp thanh kiểm tra các chỉ tiêu liên quan đến thực phẩm, đặc biệt là polyphosphat nhằm mục tiêu đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
2. CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu 2.1.1.
Luận văn đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu xác định hàm lƣợng polyphosphat (bao gồm pyrophosphat và tripolyphosphat) trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D).
Nội dung nghiên cứu 2.1.2.
Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu của đề tài, các nội dung đƣợc thực hiện bao gồm:
Tổng quan các tài liệu về phụ gia thực phẩm, đặc biệt là polyphosphat
(pyrophosphat, tripolyphosphat) và các phƣơng pháp xác định nhóm phụ gia này trong thực phẩm.
Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quy trình xác định đồng thời
pyrophosphat và tripolyphosphat bằng phƣơng pháp CE-C4D
- Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ đệm khác nhau.
- Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu,…
- Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hƣởng đến việc xác định các chất phân tích trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp CE-C4D
Khảo sát quy trình xử lý mẫu xác định polyphosphat trong thực phẩm. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu
- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn.
- Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp. - Đánh giá độ chụm, độ đúng của phƣơng pháp phân tích.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu phân tích 2.2.1.
Thu thập mẫu
Các mẫu phân tích đƣợc thu thập ngẫu nhiên tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn thành phố Hà Nội và Quy Nhơn.
Xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu
Mẫu phân tích đƣợc đồng nhất bằng cách cắt nhỏ, xay nhuyễn bằng máy xay. Mẫu sau khi đồng nhất đƣợc bảo quản trong trong túi đựng mẫu trong ngăn đá tủ lạnh (nhiệt độ < 0oC) cho đến khi phân tích. Đối với các loại thực phẩm nhƣ đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hƣ hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phịng cho đến khi phân tích.
Xử lý mẫu trƣớc khi phân tích Mẫu dạng lỏng (mẫu sữa)
Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu trƣớc đây, mẫu dạng lỏng, cụ thể là mẫu sữa đƣợc phân tích theo quy trình xử lý mẫu Hình 2.1. dƣới đây.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dạng lỏng
Mẫu dạng rắn
Các mẫu dạng rắn (nhƣ giị, chả, xúc xích, ba tê,…) đƣợc xử lý theo quy trình tối ƣu sau khi nghiên cứu, khảo sát theo phƣơng pháp đƣợc trình bày trong
Hút chính xác 5,0 mL mẫu vào ống fancol 15mL
Lắc đều, ngâm trong nƣớc sôi 15 phút
Phân tích điện di
Lọc qua giấy lọc băng xanh sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm Thêm 5,0 mL nƣớc deion
Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết 2.2.2.
nối kiểu tụ điện (CE-C4D)
Nguyên tắc: Hai chất phân tích tripolyphosphat và pyrophosphat, trong điều kiện mơi trƣờng pH> pKa, chúng tồn tại ở dạng anion do đó có khả năng di chuyển từ đầu mao quản bơm mẫu (áp điện thế phân cực âm) đi qua vị trí đặt detector dƣới tác dụng của lực điện trƣờng và đƣợc ghi nhận tín hiệu phụ thuộc vào sự chênh lệch độ dẫn của chất phân tích với dung dịch đệm (chất nền điện ly). Mỗi ion chất phân tích có điện tích và kích thƣớc khác nhau dẫn tới độ linh động điện di khác nhau. Đó là cơ sở cho q trình phân tách, định tính cũng nhƣ định lƣợng đồng thời hai ion chất phân tích trong cùng một hỗn hợp dung dịch.
Chất phân tích đƣợc định tính bằng thời gian di chuyển và nguyên tắc của việc định lƣợng dựa trên cơ sở mối quan hệ tín hiệu đo của chất phân tích và nồng độ Cx của nó theo biểu thức:
H = k. Cx hoặc A = k. Cx Trong đó: H là chiều cao, A là diện tích pic điện di của chất phân tích.
Để xác định hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu ta có thể sử dụng phƣơng pháp đƣờng chuẩn hoặc thêm chuẩn dựa trên cơ sở của sự phụ thuộc tuyến tính trên.
Phương pháp khảo sát, tối ưu điều kiện phân tích điện di 2.2.3.
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hƣởng đến kết quả của q trình phân tích bao gồm: thành phần và pH của dung dịch đệm điện di; nồng độ dung dịch đệm, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu, thế tách, đƣờng kính trong và chiều dài hiệu dụng của mao quản. Các điều này sẽ đƣợc khảo sát một cách hệ thống, theo phƣơng pháp đơn biến (biến thiên một yếu tố tại một thời điểm).
Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần, pH và nồng độ đệm
Đây là các yếu tố quan trọng nhất, quyết định đến dạng tồn tại của chất phân tích và ảnh hƣởng đến tính chất của các quá trình xảy ra trong mao quản, từ đó quyết định hiệu quả của q trình phân tích điện di. Để đạt đƣợc kết quả phân tích tốt nhất, các hệ dung dịch đệm bao gồm: L-Arginin/acetic, L-Arginin/ascorbic, L-
Histidin/acetic, L-Histidin/ascorbic đƣợc lựa chọn nghiên cứu với các giá trị pH cách nhau 0,5 đơn vị, nằm trong khoảng 4,0 đến 7,0. Sau khi lựa chọn đƣợc thành phần dung dịch và pH dung dịch đệm phù hợp nhất, nồng độ của hợp phần bazơ sẽ đƣợc khảo sát tai các giá trị: 7,0; 10,0; 15,0; 20,0 mM.
Khảo sát thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu
Cùng với dung dịch đệm, một số yếu tố khác cũng đƣợc nghiên cứu, khảo sát tại các giá trị khác nhau, cụ thể: chiều cao bơm mẫu (10cm, 15cm, 20cm); thời gian bơm mẫu (20s; 30s; 40s), thế tách (-10kV; -15kV; -18kV; -20kV).
Phương pháp khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 2.2.4.
Mẫu thực phẩm (nhƣ giò, chả, xúc xích…) là một trong những nền mẫu tƣơng đối phức tạp, có chứa nhiều thành phần khác nhau nhƣ: lipid, protein, các chất phụ gia…[1]. Vì vậy, để đạt đƣợc hiệu quả phân tích tốt, một số kỹ thuật xử lý mẫu nhằm hạn chế ảnh hƣởng của protein và lipid đƣợc nghiên cứu chi tiết trên cơ sở các quy trình phân tích đƣợc mơ tả trong sơ đồ Hình 2.2. dƣới đây.
Tách loại chất béo bằng chiết lỏng lỏng hoặc thủy phân chất béo bằng
NaOH trong thời gian 30 phút Quy trình 2 Quy trình 1 Đơng tụ protein bằng TCA hoặc nƣớc nóng Cân ~2g mẫu
Rung siêu âm 20 phút
Ly tâm 20 phút ở tốc độ 8000 vòng/phút +10,0 mL H20 deion
Ly tâm 20 phút ở tốc độ 8000 vòng/phút
Lọc qua màng lọc 0,45 µm
Các điều kiện xử lý mẫu cụ thể nhƣ loại dung môi chiết, nồng độ TCA, thời gian rung siêu âm,… đƣợc tối ƣu theo phƣơng pháp đơn biến.
Tất cả các quá trình khảo sát điều kiện xử lý mẫu đƣợc thực hiện song song giữa mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu giị lụa. Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn.
Đánh giá phương pháp phân tích 2.2.5.
2.2.5.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích
Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích phát hiện đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Giới hạn phát hiện của TriP và PyroP đƣợc xác định bằng cách pha lỗng dần dung dịch chuẩn có nồng độ 50 ppm, phân tích trên thiết bị điện di mao quản đến khi xác định đƣợc nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trên nền nƣớc deion hoặc trên nền mẫu mà cho tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N) bằng 3. Khi nồng độ nhỏ nhất đó đƣợc xác định trên nền nƣớc deion thì thu đƣợc giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) cịn khi thí nghiệm tiến hành trên nền mẫu thì thu đƣợc giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL)
Giới hạn định lƣợng (LOQ)
Thông thƣờng, giá trị LOQ đƣợc xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10. Giới hạn định lƣợng của thiết bị (IQL) và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp (MQL) cũng đƣợc phân biệt và xác định tƣơng tự nhƣ IDL và MDL [6]. Ngoài ra, giá trị của LOQ cịn có thể đƣợc xem bằng 10/3 LOD.
2.2.5.2. Độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại (độ chụm) của phƣơng pháp đƣợc xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%). Cơng thức tính SD và RSD% nhƣ sau:
SD = √∑( )
(2.1) RSD(%) =
×100 (2.2) Trong đó :
- Si là diện tích của pic điện di thứ i
- n là số lần phân tích lặp (n =6)
Các đại lƣợng này có thể đƣợc tính tốn trên phần mềm thống kê Minitab hoặc Origin.
Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích đƣợc xác định bằng cách tiến hành xử lý mẫu và phân tích lặp lại một số mẫu thực tế.
2.2.5.3. Độ đúng của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận. Do đó, thƣớc đo độ đúng thƣờng đánh giá qua sai số tƣơng đối hoặc giá trị hiệu suất thu hồi xác định đƣợc sau khi thêm chuẩn [6].
Độ thu hồi (H): H ═
× 100 (2.3) Trong đó:
- H là hiệu suất thu hồi (%)
- Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích phân tích đƣợc
- Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính tốn từ lƣợng chuẩn thêm vào.
Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trƣớc khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phƣơng pháp, còn nếu chất chuẩn đƣợc thêm vào trƣớc khi bơm vào thiết bị ta có độ thu hồi của thiết bị.
Độ thu hồi của phƣơng pháp phân tích TriP và PyroP đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn một lƣợng chính xác chất phân tích vào nền mẫu giị khơng chứa hai chất phân tích này.
Tính tốn kết quả và uớc lượng độ khơng đảm bảo đo 2.2.6.
Tính tốn kết quả
Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thêm chuẩn và đƣợc tính tốn kết quả theo cơng thức 2.4 (với mẫu dạng lỏng), công thức 2.5 (với mẫu dạng rắn) dƣới dây.
Trong đó:
là hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu dạng lỏng (mg/l); là hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu dạng rắn (µg/g); là nồng độ thêm chuẩn (mg/l);
là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo;
là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo sau khi thêm chuẩn một lƣợng chính xác đã biết ;
K là hệ số pha loãng mẫu (hoặc dung dịch phân tích); H là hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu (%); m là khối lƣợng mẫu (g)
Ước lượng độ không đảm bảo đo
Độ không đảm bảo đo đƣợc xác định theo nguyên tắc của ISO GUM và EURACHEM [12].
Xác định nguồn khơng đảm bảo đo
Các nguồn có liên quan đến độ khơng đảm bảo đo thành phần (cịn gọi là độ không đảm bảo chuẩn) đƣợc xác định và thể hiện trong hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ các nguồn không đảm bảo đo
Xác định độ không đảm bảo thành phần