CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp
2.2.1. Chuẩn bị bào tử B aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid
Bào tử B. aquimaris SH6: Chủng vi khuẩn sinh sắc tố B. aquimaris SH6 phân
lập từ ruột tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu trước của Ngo và cộng sự [48] được sử dụng để tạo bào tử phục vụ cho nghiên cứu này. Quy trình tạo bào tử được thực hiện như sau: Tế bào sinh dưỡng B. aquimaris SH6 được hoạt hóa bằng cách cấy ziczac trên đĩa thạch LB, ủ 16 h ở 35°C, 2-3 khuẩn lạc màu vàng cam riêng rẽ trên đĩa được cấy vào 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong khoảng 16-18 h để tạo chủng giống cấp 1. Cấy chuyển 1 ml giống SH6 cấp 1 vào 10 ml LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 16-18 h để rạo chủng giống cấp 2. Cấy chuyển 10 ml giống SH6 cấp 2 vào 500 ml (tỷ lệ 1:50) môi trường DSM lỏng, ni lắc ở tốc độ 200 vịng/phút trong 48-72 h để tạo bào tử. Nhiệt độ nuôi lắc đối với SH6 là 33-35°C. Trong khoảng thời gian sau 48 h nuôi lắc trong môi trường DSM, dịch nuôi sẽ được kiểm tra hiệu suất hình thành bào tử bằng kính hiển vi quang học cho tới khi đạt hiệu suất > 95% tạo bào tử. Khi đạt hiệu suất tạo bào tử > 95%, ly tâm dịch nuôi bào tử
bằng máy ly tâm SIGMA 3K - Đức ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ dịch nuôi, thu sinh khối bào tử SH6 màu vàng cam. Sau đó, rửa bằng dung dịch muối NaCl 0,9%, vontex, sau đó ly tâm 7000 vịng/phút trong 10 phút để loại dịch rửa (lặp lại 2-3 lần). Cuối cùng, bào tử SH6 được trộn với dung dịch NaCl 0,9%, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Để xác định nồng độ bào tử (CFU/ml), chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu bào tử SH6 bảo quản trong NaCl 0,9% ở trên đến nồng độ pha loãng 10-7 và cấy trải dịch pha loãng ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp (10-5, 10-6, 10-7) trên đĩa thạch LB hoặc DSM để đếm số khuẩn lạc hình thành (CFU), từ đó xác định nồng độ bào tử bằng cơng thức:
CFU/ml = 𝛴𝐶
𝑛1𝑣1𝑑1 + … + 𝑛𝑖𝑣𝑖𝑑𝑖 Trong đó:
- CFU/ml: số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu
- C: Tổng số tế bào vi khuẩn đếm được trên mỗi đĩa ở độ pha loãng tương ứng (25-250 khuẩn lạc)
- ni: Số đĩa petri cấy tại độ pha loãng tương ứng - di: Hệ số pha loãng tương ứng
- vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa tại độ pha lỗng tương ứng
Mơi trường ni cấy và các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong q trình ni cấy được đều được khử trùng ở 121°C trong 15 phút để loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật nhiễm từ mơi trường bên ngồi.
Tách chiết carotenoid:
Để thu dịch chiết carotenoid từ tế bào SH6, tế bào sinh dưỡng B. aquimaris SH6 được kích hoạt bằng cách cấy ziczac trên đĩa thạch LB, ủ 16 h ở 35°C, 2-3 khuẩn lạc màu vàng cam riêng rẽ trên đĩa được cấy vào 5 ml môi trường LB lỏng, ni lắc ở tốc
độ 200 vịng/phút trong khoảng 16-18 h để tạo chủng giống cấp 1. Cấy chuyển 1 ml giống SH6 cấp 1 vào 10 ml LB lỏng, ni lắc ở tốc độ 200 vịng/phút trong 16-18 h để rạo chủng giống cấp 2. Cấy chuyển 10 ml giống SH6 cấp 2 vào 500 ml (tỷ lệ 1:50) môi trường LB lỏng, ni lắc ở tốc độ 200 vịng/phút trong 24 h để thu tế bào sinh dưỡng. Nhiệt độ nuôi lắc đối với SH6 là 33-35°C. Sau 24 h, tiến hành ly tâm thu sinh khối. Phương pháp tách chiết carotenoid được tham khảo từ các nghiên cứu trước đây [34]. Tuy nhiên, sử dụng dung môi tách chiết là hỗn hợp methanol:chloroform có thể dẫn đến hiện tượng gây độc với tôm khi cho ăn với thức ăn trộn dịch chiết carotenoid có chứa methanol hoặc chloroform. Vì vậy, chúng tơi sử dụng dung môi tách chiết là dầu gan cá. Sinh khối tế bào SH6 được làm đơng ở -80°C trong 4 h, sau đó giã nhuyễn trên đá và phá tế bào bằng máy phá tế bào (Sonicator – Q500, USA). Dịch chiết carotenoid được đo quang phổ vạch hấp phụ ở bước sóng 480 nm (A480) và dựa vào phương trình đường chuẩn nồng độ astaxanthin (Hình 2.3) để xác định nồng độ astaxanthin trong dịch chiết. Dịch chiết carotenoid được bảo quản ở -20°C để phục vụ thí nghiệm tiếp theo.