3.4. Vai trò của bào tử B. aquimaris SH6 trong tăng cường miễn dịch của tôm
thẻ chân trắng
Để xác định vai trò và tác dụng của bào tử SH6 đối với hệ miễn dịch của tôm, các thử nghiệm đã được tiến hành đối với một số chỉ thị sinh học tại thời điểm 28 D so với 0 D. Đầu tiên là chỉ thị sinh học phân tử - mRNA Rho. Mức độ biểu hiện gen Rho
được đánh giá bằng phản ứng Real-time PCR sử dụng tín hiệu huỳnh quang SYBR Green (xem phần Phương pháp). Kết quả thu được được trình bày trong Hình 3.10A.
Hình 3.10: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Mức độ biểu hiện
mRNA Rho. B - Mức độ biểu hiện mRNA Ran. *P<0,05, **P<0,01.
Trong đó, mức độ biểu hiện mRNA Rho ở tơm thuộc nhóm "SH6 spore" tăng lên đáng kể sau 28 ngày nuôi (2-ΔΔCt = 23,2), cao hơn gấp 8.1 (P < 0,05) lần so với tơm ở nhóm “ĐC” (2-ΔΔCt = 2,8). Trong khi đó, ở nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid",
mức độ biểu hiện gen Rho khá thấp, chỉ sấp xỉ nhóm “ĐC” (giá trị 2-ΔΔCt lần lượt là 4,4 và 3,4). Ngoài mRNA Rho, mRNA Ran cũng được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của bào tử SH6 đối với hệ miễn dịch tôm. Rõ ràng rằng, mức độ biểu hiện gen Ran tăng
đáng kể ở ngày 28 so với ngày 0. Tuy nhiên, chúng tôi phát hiện ra rằng, mRNA Ran biểu hiện ở mức rất cao ở tơm thuộc nhóm "Carophyll" (2-ΔΔCt = 367, cao hơn 6 lần) và "SH6 carotenoid" (2-ΔΔCt = 1459, cao hơn 25 lần) so với nhóm “ĐC” (2-ΔΔCt = 58), trong khi chỉ số này ở nhóm tơm "SH6 spore" khá thấp (2-ΔΔCt = 38) và khơng khác biệt so với nhóm “ĐC” (Hình 3.10B). Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra bằng chứng chứng minh rằng Rho và Ran là một trong các thành phần trong hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng. Cụ thể, tác giả Kim và cộng sự (2004) [36], Pan và cộng sự (2005) [56], Han và cộng sự (2007) [28] đã chỉ ra rằng tôm kháng vi rút đốm trắng cho thấy mức độ biểu hiện gen Rho và Ran tăng lên đáng kể so với tôm không kháng vi rút, đồng nghĩa với việc tăng biểu hiện gen Rho hoặc Ran là biểu hiện hệ miễn dịch của tôm được tăng cường. Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên một cách rõ rệt ở
nhóm ăn bào tử B. aquimaris SH6. Điều này chứng tỏ việc cho tôm ăn bào tử với nồng độ thích hợp đem lại hiệu quả tăng cường miễn dịch cho tôm. Riêng với chỉ thị sinh học phân tử thứ 2 là gen Ran, chúng tơi phát hiện ra rằng, nhóm tơm ăn bào tử SH6 có mức độ biểu hiện gen Ran khơng tăng so với nhóm “ĐC”. Theo như báo cáo của Pan và cộng sự (2005), Ran liên quan trực tiếp tới quá trình vận chuyển một số chất qua
nhân, và tăng biểu hiện ở tôm kháng vi rút. Vậy, câu hỏi đặt ra là, khi không sử dụng vi rút như một tác nhân xâm nhập thì việc tăng cường hệ miễn dịch có liên quan một cách tuyến tính với mức độ biểu hiện gen Ran không? Trong trường hợp sử dụng bào tử
SH6, có thể hệ miễn dịch của tôm được tăng cường một cách đáng kể (mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên 8 lần so với nhốm “ĐC”). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, tác nhân ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của tôm được sử dụng là bào tử vi khuẩn, là những phân tử có kích thước lớn hơn nhiều so với vi rút. Do vậy, giả thiết hợp lý là hệ thống miễn dịch của tơm sẽ kích hoạt cơ chế thực bào dẫn tới việc tăng một cách đáng kể biểu hiện gen Rho. Trong khi, bào tử vi khuẩn không tác động trực tiếp đến quá trình
vận chuyển các chất qua nhân, dẫn đến không thay đổi mức độ biểu hiện gen Ran. Vì vậy, mức độ biểu hiện gen Ran ở nhóm “SH6 spore” khơng khác biệt so với nhóm
“ĐC”. Điều này cần được làm sáng tỏ trong các nghiên cứu tiếp theo về tác động của bào tử ci khuẩn đến mức độ biểu hiện gen Ran nói riêng và hệ thống miễn dịch của tơm thẻ chân trắng nói chung.
Ngồi chỉ thị sinh học phân tử là mRNA Rho/Ran, PO và SOD là 2 chỉ tiêu
được sử dụng khá phổ biến để đánh giá khả năng miễn dịch ở tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm đo đạc và xác định hoạt tính enxyme PO và SOD tại các thời điểm 0 D và 28 D của q trình ni tơm. Hình 3.11A thể hiện hoạt tính enzyme PO giữa các nhóm thí nghiệm. Dựa vào kết quả biểu thị trên Hình 3.11A, có thể thấy rằng hoạt tính enzyme PO đạt mức tương đối đồng đều ở cả bốn nhóm thí nghiệm. Đến ngày 28, chỉ số này tăng lên rõ rệt ở tất cả các nhóm. Trong đó, sự tăng trưởng mạnh mẽ nhất được thể hiện ở tơm thuộc nhóm "SH6 spore", cụ thể, hoạt tính enzyme PO ở nhóm này cao hơn gấp 2 lần so với nhóm “ĐC” (ΔA490: 0,63 và 0,29, P
< 0,01). Trong khi đó, giá trị ΔA490 của tơm thuộc nhóm đối chứng dương lần lượt là: "Carophyll" (ΔA490: 0.33), "SH6 carotenoid" (ΔA490: 0,35, P < 0,05), các giá trị này
cho thấy hoạt tính enzyme PO ở hai nhóm này cũng tăng lên so với nhóm “ĐC” và so với ngày 0, nhưng khác biệt này khơng có hoặc có ý nghĩa thống kê thấp hơn nhiều so với nhóm "SH6 spore". Kết quả tăng hoạt tính enzyme PO này là bằng chứng chứng minh đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng đã tăng lên một cách đáng kể khi tôm được cho ăn với thức ăn bổ sung bào tử B. aquimaris SH6. Điều này tuong đồng với
một số nghiên cứu đã có trước đây về mối liên hệ giữa đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng và hoạt độ enzyme PO, thể hiện vai trò của các chủng probiotic, như nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2008) trên đối tượng tôm thẻ chân trắng bị nhiễm vi rút đốm trắng [51]. Đồng thời củng cố kết quả của nghiên cứu trước đó của Ngo và cộng sự (2016) về ảnh hưởng của B. aquimaris SH6 đến hoạt tính enzyme PO của tơm [48].
Hình 3.11: Chỉ số miễn dịch ở tơm tại ngày 0 và ngày 28. A - Hoạt tính enzyme PO. B
- Hoạt tính enzyme SOD. *P<0,05; **P<0,01.
Đối với chỉ thị SOD, Hình 3.11B chỉ ra rằng hoạt tính enzyme SOD tại ngày 28 của các nhóm "Carophyll", "SH6 spore" và "SH6 carotenoid" đều tương đương nhau (lần lượt là 51,78; 50,2 và 52,86 unit/g tôm), cao hơn so với nhóm “ĐC” cùng ngày (40,94 unit/g tơm). Tuy nhiên, hoạt tính enzyme SOD ở tơm thuộc cả 4 nhóm ở ngày 28 đều không thay đổi so với ngày 0, thậm chí chỉ số này cịn giảm ở nhóm “ĐC”. Trong khi ở nhóm “ĐC”, chỉ số SOD giảm đáng kể giữa ngày 28 so với ngày 0. Mặc dù cả Rho và SOD đều là hai chỉ số miễn dịch liên quan đến cơ chế miễn dịch của tôm
thẻ chân trắng thơng qua cơ chế thực bào và đã có nghiên cứu chứng minh rằng Rho là một protein liên quan đến quá trình hình thành superoxide. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được sự tăng lên đáng kể về mức độ biểu hiện gen Rho,
trong khi khơng phát hiện có sự tăng lên về hoạt độ enzyme SOD ở tôm được ăn bào tử SH6. Để lý giải cho kết quả này, chúng tôi cho rằng: Mức độ biểu hiện gen Rho tăng lên rõ rệt, chứng tỏ tác dụng tăng cường miễn dịch của bào tử SH6. Tuy nhiên, việc xác định hoạt độ enzyme SOD sử dụng phương pháp hóa sinh học, dựa vào các phản ứng hóa học mơ phịng bên ngoài tế bào để đo đạc, đánh giá hoạt tính enzyme SOD. Phương pháp này có thể khơng đủ chính xác để đo đạc được những thay đổi nhỏ, dẫn đến khi trình bày số liệu dưới dạng biểu đồ khơng thể quan sát được những thay đổi này. Trong khi sử dụng phương pháp sinh học phân tử (Real-time PCR) đánh giá biểu hiện gen lại có tính chính xác cao, có khả năng phát hiện những thay đổi rất nhỏ để biểu thị trên biểu đồ với giá trị chênh lệch quan sát được. Như vậy, chúng tôi giả thiết rằng, việc gia tăng mức độ biểu hiện gen Rho, là cơ sở chứng minh sự tăng cường tổng hợp superoxide, tuy nhiên, chưa đủ mạnh để biểu thị bằng giá trị hoạt tính enzyme SOD. Do vậy, cần có những nghiên cứu tiếp theo với các đối tượng tơm có kích thước và trọng lượng lớn hơn cũng như bố trí thí nghiệm với thời gian dài hơn để đánh giá chính xác hơn về chỉ tiêu miễn dịch tôm – SOD.
Từ những kết quả đánh giá các chỉ tiêu miễn dịch trên, có thể kết luận rằng, bào tử SH6 nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn có tác dụng tăng cường đối với 2 chỉ thị miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng là mRNA Rho và hoạt tính enzyme PO.
3.5. Tăng trưởng về trọng lượng của tôm khi ăn bào tử B. aquimaris SH6.
Tuy không phải là một trong các chỉ tiêu miễn dịch, song tăng trưởng trọng lượng cũng là một chỉ tiêu quan trọng phản ánh sức khoẻ của tôm thẻ chân trắng nên chúng tôi cũng kết hợp đánh giá song song với chỉ số miễn dịch trong nghiên cứu này.
Trọng lượng của tôm được cân tại 0 D và 28 D của chu kỳ thí nghiệm. Sử dụng cơng thức tính tốc độ tăng trưởng để đánh giá mức độ tăng trọng lượng của tôm trong giai đoạn 28 ngày nuôi ở điều kiện phịng thí nghiệm. Từ đó, so sánh mức độ tăng trọng của tôm ăn thức ăn chứa bào tử (nhóm “SH6 spore”) với các nhóm tơm không ăn bào tử B. aquimaris SH6 (“ĐC”, “Carophyll”, “SH6 carotenoid”).
Rõ ràng rằng tốc độ tăng trưởng của tơm ở nhóm "SH6 spore" cao hơn đáng kể so với 3 nhóm tơm cịn lại. Cụ thể, tốc độ tăng trưởng của tơm nhóm "SH6 spore" đạt mức 3,38 %/ngày (P < 0,01), cao gấp 2,33 lần so với nhóm “ĐC” (1,45 %/ngày). Trong khi 2 nhóm cịn lại là "Carophyll" và "SH6 carotenoid" cũng chỉ có tốc độ tăng trưởng tương đương với nhóm “ĐC” và thấp hơn rõ rệt so với nhóm "SH6 spore" (Hình 3.12). Kết quả này chỉ ra rằng, bào tử SH6 có vai trị đáng kể trong việc thúc đẩy tơm tăng trưởng về trọng lượng nhờ việc kích thích sản sinh các enzyme tiêu hóa hỗ trợ q trình tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng cho tơm.
Hình 3.12: Tốc độ tăng trưởng (%/ngày) của tôm thẻ chân trắng ở các nhóm thí
nghiệm khác nhau. Giá trị trung bình với cỡ mẫu n = 20 (**P < 0,01) .
3.6. Nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm
Bên cạnh tốc độ tăng trưởng của tôm, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng tăng cường tổng hợp astaxanthin cho tôm của bào tử sinh sắc tố B. aquimaris SH6
bằng cách xác định nồng độ astaxanthin và màu sắc ở tơm thuộc mỗi nhóm thí nghiệm. Sau 28 ngày nuôi, n = 5 tơm ở mỗi nhóm thí nghiệm được giải phẫu, loại bỏ lớp vỏ kitin, thu phần thịt tôm để tách chiết astaxanthin (xem phần Phương pháp). Như kết quả trình bày trong Hình 3.13, có thể thấy rằng nồng độ astaxanthin ở nhóm tơm "Carophyll" và "SH6 carotenoid" (lần lượt là 5,3 và 3,9 µg/g tơm) cao vượt trội so với nhóm “ĐC” (1,2 µg/g tơm), P < 0,05. Tuy khơng cao vượt trội như nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid", nhưng nồng độ astaxanthin ở nhóm "SH6 spore" (1,9 µg/g tơm, P
< 0,05) cũng cao hơn nhiều so với nhóm “ĐC”.
Hình 3.13 Nồng độ astaxanthin của tôm tại thời điểm 28 D. *P<0,05
Để củng cố kết luận về khả năng kích thích tổng hợp astaxanthin giữa bốn nhóm thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đo màu sắc của tôm khi luộc (n = 5). Kết quả đo màu sắc tôm khá tương đồng với nồng độ astaxanthin của tơm ở mỗi nhóm (Hình 3.14), tơm thuộc các nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid" có màu đỏ cam đậm hơn hẳn (Điểm màu: 22-23), theo sau đó là tơm ở nhóm "SH6 spore" (Điểm màu: 21-22) và cuối cùng là nhóm “ĐC” (Điểm màu: 20).
Hình 3.14: Màu sắc của tơm sau khi luộc tại thời điểm 28 D
Kết hợp kết quả đo nồng độ astaxanthin và đánh giá màu sắc của tôm bằng thang màu Roche - SalmoFanTM, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
(1) Mối tương quan giữa nồng độ astaxanthin và màu sắc của tơm giữa bốn nhóm nghiên cứu chứng minh rằng astaxanthin đóng một vai trị then chốt trong sự hình thành sắc tố đỏ vàng ở tôm. Đồng thời cũng là bằng chứng khẳng định rằng carotenoid sản sinh bởi bào tử B. aquimaris SH6 đã được hấp thụ và chuyển hóa thành astaxanthin ở tôm thẻ chân trắng một cách hiệu quả.
(2) Một tỷ lệ % nhất định của bào tử B. aquimaris SH6 có khả năng nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng và sinh tổng hợp carotenoid trong ruột tôm và carotenoid này được chuyển hố thành cơng thành astaxanthin có tác dụng làm tăng màu đỏ của tơm.
(3) Mặc dù sử dụng với nồng độ thấp hơn 100 lần (5 µg/g thức ăn), nhưng SH6 carotenoid ở dạng dịch chiết được hấp thu và chuyển hố thành cơng thành astaxanthin tương đương với astaxanthin tổng hợp trong Carophyll (0,5 mg/g thức ăn). Điều này
cho thấy rằng, carotenoid tự nhiên tách chiết trực tiếp từ tế bào SH6 được hấp thụ và chuyển hóa thành astaxanthin trong mơ tôm hiệu quả cao hơn nhiều so với astaxanthin dạng tổng hợp. Tuy nhiên, sử dụng SH6 carotenoid sẽ phải đối mặt với vấn đề chi phí và kỹ thuật khi tách chiết và bảo quản. Hơn nữa, "Carophyll" và "SH6 carotenoid" cho hiệu quả kích thích tốc độ tăng trưởng của tôm thấp hơn so với "SH6 spore".
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Dựa và những kết quả đã thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau đây:
1. Bào tử B. aquimaris SH6, sử dụng với nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn, có khả năng lưu trú, tồn tại trong ruột tôm thẻ chân trắng và số lượng SH6 tăng lên theo thời gian, từ 4,1 × 104 CFU/g ruột tôm tại ngày 1 đến 5,33 × 105 CFU/g ruột tơm ở ngày thứ 28. Bên cạnh đó, sử dụng bào tử B. aquimaris SH6 cho thấy sự tăng lên đáng kể về số lượng và đa dạng hệ vi sinh vật đường ruột của tôm, bằng chứng là sự xuất hiện một số chủng vi sinh vật có lợi như B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, M. chocolatum, S. amazonensis,… ở nhóm tơm được cho ăn
bào tử B. aquimaris SH6.
2. Bào tử B. aquimaris SH6 lần đầu tiên được chứng minh có khả năng nảy mầm
trong ruột tơm ngay sau 4 h cho ăn với tỷ lệ 0,03% và đạt ngưỡng 27,87% tại thời điểm 24 h.
3. Bào tử B. aquimaris SH6 có tác dụng kích thích, tăng cường hệ miễn dịch tôm
thẻ chân trắng, thể hiện qua sự tăng mức độ biểu hiện mRNA gen Rho lên 8,1
lần và hoạt tính enzyme PO tăng gấp 2 lần so với tôm không ăn bào tử.
4. Bào tử B. aquimaris SH6 (nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn) được đánh giá là có tiềm năng đáng kể trong việc sử dụng làm chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn cho tơm giúp thúc đẩy q trình tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp tôm tăng trưởng nhanh về trọng lượng (tăng lên 2 lần so với tôm không được ăn bào tử). Bên cạnh đó, bào tử B. aquimaris SH6 sinh carotenoid hứa hẹn khả năng giúp
tôm tăng khả nang tổng hợp astaxanthin (nồng độ astaxanthin ở tôm ăn bào tử
B. aquimaris SH6 cao hơn gấp 2 lần so với tôm không được ăn bào tử) ở tôm,
Kiến nghị
1. Mở rộng nghiên cứu hoạt tính probiotic của bào tử B. aquimaris SH6 ở các nồng độ bào tử khác nhau và lựa chọn nồng độ tối ưu áp dụng trên quy mô thực địa để đánh giá hiệu quả sử dụng của probiotic dạng bào tử.
2. Nghiên cứu thêm về khả năng tái hình thành bào tử của B. aquimaris SH6 trong ruột tôm để đánh giá chu kỳ sống của chúng.
3. Phát triển sản phẩm thương mại dạng thức ăn nuôi tôm bổ sung bào tử B. aquimaris SH6.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Viện Kinh tế và Quy hoạch Thủy sản. (2015). BÁO CÁO - Thực hiện kế hoạch năm 2017, nhiệm vụ, giải pháp chủ yếu thực hiện kế hoạch năm 2018.
2. Huỳnh Hữu Điền, Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú (2015), Ảnh hưởng
của các dòng vi khuẩn Bacillus đến sinh trưởng, tỷ lệ sống và các yếu tố môi trường trong bể ni tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), Tạp chí Khoa
học Trường Đại học Cần Thơ, 36, pp. 98-106.
3. Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lư (2006), Kỹ thuật nuôi tôm thẻ chân trắng, Nhà Xuất