Dung dịch mẹ sau khi pha có thể chia nhỏ ra các tube, bảo quản ở -200C. Khi cần lấy ra làm tan băng và dùng trong ngày, lƣợng thừa sẽ bỏ đi. Các ống chứa dung dịch kháng sinh pha loãng cần dùng đƣợc bảo quản ở 40C và dùng trong ngày.
b. Chuẩn bị các đĩa thạch kháng sinh
Môi trƣờng thạch đƣợc dùng trong thí nghiệm xác định MIC của phế cầu là Mueller-Hinton (MH) với 5% máu cứu, đƣợc chuẩn bị theo các bƣớc sau đây:
- Cân bột Mueller-Hintontheo tỷ lệ hƣớng dẫn của nhàsản xuất và hòa tan vào nƣớc cất.Đun sơi để hồ tan hồn tồn bột.
- Hấp tiệt trùng môi trƣờng ở 1200C trong 15phút, môi trƣờng sẽ luôn đƣợc giữ ở 500C trong quá trình chuẩn bị và đổ ra đĩa.
- Qúa trình đổ thạch sẽ đƣợc tiến hành đối với từng loại kháng sinh và thực hiện từ nồng độ kháng sinh thấp đến cao. Cho vào một bình tam giác (loại 50ml vơ
trùng) 18ml thạch cộng với 2ml dung dịch kháng sinh cần dùng. Lắc đều và đổ ra đĩa. Có thể sử dụng 1 bình tam giác cho 1 loại kháng sinh. Lúc này kháng sinh đã đƣợc pha loãng 10 lần sao với nồng độ gốc đƣợc sử dụng, cuối cùng sẽ thu thu đƣợc 16 đĩa thạch chứa kháng sinh từ nồng độ 128 đến 0.004µg/ml. - Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chƣa dùng ngay thì gói kín và bảo
quản ở trong tủ lạnh (2-80C) trong vòng 2 tuần.
Khi sử dụng, nếu mặt thạch ƣớt thì phơi khơ bề mặt trong tủ ấm (35-370C) khoảng 15-30 phút. Úp ngƣợc và không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm. Đánh dấu phía trên và phía dƣới đĩa thạch để tránh nhầm lẫn số thứ tự chủng khi đọc kết quả.
Mỗi lần làm MIC cần ít nhất 2 đĩa mơi trƣờng MH khơng có kháng sinh để làm chứng môi trƣờng và theo dõi sức sống của vi khuẩn ở trƣớc và sau khi đƣợc chấm vào thạch có chứa kháng sinh. Chủng chuẩn Streptococcus pneumoniae ATCC 49619sẽ đƣợc dùng để làm chứng dƣơng.
c. Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn dịch vi khuẩn
Mỗi chủng phế cầu trƣớc khi làmthử nghiệm MIC cần đƣợc cấy khôi phu ̣c vào mơi trƣờng thạch máu khơng có chất ức chế giống quy trình ni cấy định danh ở trên, để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ . Xác định lại các chủng phế cầu nghi ngờ hoă ̣c bi ̣ nhiễm. Cấy chuyển thuần p hế cầu sang mô ̣t đĩa tha ̣ch mới để sƣ̉ du ̣ng cho kỹ thuâ ̣t MIC . Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng gă ̣t khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex. Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ đƣợc so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland. Huyền dịch của các chủng vi khuẩn sẽ đƣợc chuẩn bị có độ đục nhƣ nhaubằng cách cho thêm nƣớc muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn. Pha lỗng 100 lần huyền dịch có độ đục tƣơng đƣơng độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl huyền dịch này cho vào 2ml nƣớc muối sinh lý để đƣợc huyền dịch nồng độ 106 vk/ml. Ngồi ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách gă ̣t khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trƣờng (canh thang Mueller-Hinton hoặc canh thang TSB). Ủ ở 370C qua đêm để vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có đƣợc độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.
Lưu ý: luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với chủng chuẩn Quốc tế để
kiểm tra chất lƣợng của qui trình
d. Tiến hành
Hút 0.5ml huyền dịch vi khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn /ml cho vào mỗi giếng của khay inox 32 giếng đã đƣợc sấy vô trùng theo sơ đồ số của các chủng [Sơ đồ 2.1].
Dùng bộ cấy phiên bản 32 đầu đinh (mỗi đầu có khả năng mang 10µl huyền dịch vi khuẩn) chấm vào giếng, sau đó đặt nhẹ nhàng (khơng để chân đinh ấn sâu vào thạch), chính xác (chỉ đặt 1 lần, khơng di chuyển) lên đĩa thạch MH khơng có kháng sinh. Tiếp tục chấm và đặt lên các đĩa thạch đã có sẵn kháng sinh từ nồng độ cao đến nồng độ thấp. Lần lƣợt thực hiện cho 13 loại kháng sinh. Cuối cùng trƣớc khi kết thúc, chấm vào đĩa thạch MH khơng có kháng sinh một lần nữa để làm chứng.
Lưu ý: Hƣớng trên dƣới của đĩa thạch đƣợc đánh dấu trƣớc khi chấm để tránh
nhầm lẫn số thứ tự chủng khi đọc kết quả.
Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phịng trong 30 phút cho khơ sau đó chuyển vào ủ ở 370C trong vòng 18-20 giờ. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 chủng chuẩn 1 chủng chuẩn 2
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chấm chủng bằng bộ cấy 32 giếng 2.5.8.2. Đọc và phân tích kết quả
Trƣớc tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng khơng có kháng sinh để kiểm tra sự thuần khiết của chủng và đảm bảo chủng không bị chết trƣớc và trong khi tiến hành thử nghiệm. Nếu các chủng đảm bảo mọc tốt và thuần khiết cả trƣớc và sau thử nghiệm thì mới tiếp tục đọc kết quả của chủng chuẩn và chủng thí nghiệm.
Kiểm tra tình trạng mọc của vi khuẩn sau khi ủ qua đêm ở 37oC [Hình 2.6]. Đọc kết quả của các chủng chuẩn Quốc tế trƣớc, so sánh kết quả MIC của các chủng chuẩn với khoảng nhạy cảm kháng sinh nhƣ ở Bảng 12, nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt đƣợc chuẩn thức: nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dƣỡng của môi trƣờng, mật độ của vi khuẩn… Nhƣ vậy có thể tiếp tục đọc kết quả ở những chủng thí nghiệm. Nếu khơng đạt đƣợc nhƣ trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đúng chuẩn thức.
Đọc kết quả lần lƣợt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất đến cao nhất. Nồng độ MIC đƣợc xác định ở đĩa mơi trƣờng mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc. Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh đƣợc ghi nhận vào bảng mẫu [Phụ lục 3]. Ở nồng độ thấp nhất (0.04µg/ml) mà khơng có vi khuẩn mọc thì kết quả MIC đƣợc ghi nhận là ≤0.04µg/ml. Trong trƣờng hợp đến nồng độ cao nhất (128µg/ml) mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả MIC đƣợc ghi nhận là ≥128µg/ml.
Kết quả MIC của các chủng sẽ đƣợc so sánh với nồng độ của các khoảngnhạytƣơng ứng với tùng loại kháng sinh [Bảng 2.8] để xác định tính khángcủa vi khuẩn đối với loại kháng sinh đó là nhạy cảm, trung gian hay kháng.
2.5.9. Xƣ̉ lý và phân tích sớ liê ̣u
Các phân tích thống kê sẽ đƣợc tiến hành bằng phần mềm STATA chạy trên Windows. Kiểm đi ̣nh Student’s t sẽ đƣợc sƣ̉ du ̣ng để xác đi ̣nh mƣ́c đô ̣ khác biê ̣t ở các biến liên tu ̣c , và các kiểm định chi -square cũng sẽ đƣợc dùng để kiểm tra ý nghĩa thống kê các so sánh tỉ lê ̣. Số liê ̣u có ý nghĩa thống kê khi p< 0,05.
2.5.10. Các biến số nghiên cứu
Các biến số nghiên cứu chính bao gờm:
- Biến số tỷ lệ mang phế cầu: mô ̣t chủng đƣợc xác đi ̣nhlà phế cầu khi thỏa mãn 2 điều kiện. Thứ nhất là có hình thái tan máu alpha trên môi trƣờng thạch máu nuôi cấy và dƣơng tính với thƣ̉ nghiê ̣m Optochin (vòng ức chế ≥ 14mm), và điều kiê ̣n thứ hai có tính qút đi ̣nh là đƣợc khẳng đi ̣nh bằng kết quả dƣơng tính vớilytAvà/hoặc cpsAtrong phản ƣ́ng PCR sàng lo ̣c với 2 că ̣p mồi khuếch đa ̣i gen lytA và cpsA.
- Biến số tỷ lệ phân bố týp huyết thanh của phế cầu: các chủng phế cầu đƣợc xác định mang týp huyết tha nh nào đó khi dƣơng tính trong phản ƣ́ng PCR xác định týp huyết thanh với că ̣p mồi tƣơng ƣ́ng (cpsA là gen nội đối chứng và
tính trong phản ứng khuếch đại với ≥ 2 că ̣p mồi (cpsAlà gen nội đối chứng và
có thể âm tính hoặc dƣơng tính).
- Biến số tỷ lệ kháng kháng sinh của phế cầu: tùy thuộc vào từng loại kháng sinh, kết quả MIC sẽ diễn giải mƣ́c đô ̣ nha ̣y cảm của phế cầu với kháng sinh đó. Kết quả MIC đƣợc diễn giải dƣ̣a vào hƣớng dẫn đƣợc thiết lâ ̣p theo CLSI năm 2012. Một chủng phế cầu đƣợc gọi là đa kháng thuốc khi chủng đó kháng trung gian hoặc kháng Penicillin và đồng thời với ít nhất 2 loại kháng sinh khác khơng phải nhóm β-lactam[27], [88].
CHƢƠNG 3 - KẾTQUẢ
3.1.Kết quả xác định tỷ lệ mangStreptococcus pneumoniaeở trẻ em mắc ARI
3.1.1. Kết quả thu thập mẫu và đặc điểm cơ bản của những ca trẻ mắc ARI
Tƣ̀ 01/10/2014 đến 26/09/2015, nghiên cƣ́u đã thu thâ ̣p đƣợc 1128 mẫu di ̣ch ty ̣ hầu của bê ̣nh nhân nhi mắ c ARI (theo đi ̣nh nghĩa ca bê ̣nh của WHO ) tại Khoa Nhi , Bê ̣nh viê ̣n Đa khoa tỉnh Khánh Hịa. Trong số đó có 90,78% (1024/1128) trẻ dƣới 5 tuổi, và tỷ lệ nam giới là 55,94% (631/1128). Cho thấy, trẻ dƣới 5 tuổi là nhóm tuổi nhi (≤ 15 tuổi) có tỷ lệ mắc ARI cao nhất.
3.1.2. Kết quả nuôi cấy đi ̣nh danh Streptococcus pneumoniae
Kết quả nuôi cấy định danh của 1128 mẫu dịch tỵ hầu xác định đƣợc325 mẫudƣơng tính với S. pneumoniaethông qua biểu hiê ̣n hình thái tan máu alpha vàdƣơng tính với Optochin[Hình 3.1].Nhƣ vâ ̣y, tỷ lệ mang phế cầu trong đƣờng mũi họng ở những bệnh nhâ n nhi mắc ARI thu đƣơ ̣c bằng phƣơ ng pháp nuôi cấy và đi ̣nh danh là 28,8% (325/1128) [Sơ đồ 3.1].
Hình 3.1: Hình ảnh nuôi cấy đi ̣nh danh phế cầu
Phế cầu được nuôi cấy trên thạch máu 5% (A); và tạo vòng ức chế của Optochin (B)
3.1.3. Kết quả sàng lọc phế cầu bằng PCR đa mồi
Hình 3.2 là kết quả điện di sản phẩm của phản ứng PCR đa mồi sàng lọc phế cầu bằng 2 gen lytA và cpsA.
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sàng lọc phế cầu
Kết quả sàng lọc phế cầu bằng PCR đa mồixác định đƣợc có 309/309 mẫu dƣơng tính với lytA, 274/309 mẫu dƣơng tính với cpsA. Nhƣ vậy có 309/325mẫuđƣợc khẳng định làphế cầu. Và nhƣ đã đƣợc chứng minh nhiều trƣớc đó, có thể thấy gen
lytA đă ̣c hiê ̣u hơn gen cpsA trong viê ̣c phát hiê ̣n phế cầu từ các chủng phân lập bằng phƣơng pháp PCR[42], [81].
Sàng lọc phế cầu n (%) Mô tả
lytA- cpsA- 16/325 (4,92) Không phải là phế cầu
lytA- cpsA+ lytA+ cpsA+ lytA+ cpsA- 0/325 (0) 274/325 (84,31) 35/325 (10.77) 309/325 Phế cầu Phế cầu Phế cầu
Được xác định là phế cầu Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc phế cầu bằng PCR với lytA và cpsA
lytA cpsA
Tỷ lệ các mẫu sau sàng lọc thu đƣợc gồm có, các mẫukhơng phải là phế cầu với
lytA- cpsA- (16/325),các mẫu là phế cầu với lytA+cpsA+ (274/325) hoặclytA+cpsA-
(35/325)hoặc lytA- cpsA+(0/325)[Bảng 3.1].Kết quả cuối cùng thu đƣợc là tỷ lệ mang phế cầu trong mũi họng của trẻ em mắc ARI nhập viện vào Bệnh viện Đa khoa Khánh Hòa là 27,4% (309/1128) [Sơ đồ 3.1]. Trong đó số trẻ dƣới 5 tuổi chiếm 96,12% (297/309).
Sơ đồ 3.1: Số ca bê ̣nh nhi mắc ARI được tuyển chọn và mẫu di ̣ch ty ̣ hầu
3.2. Kết quả xác định sự phân bố týp huyết thanh của phế cầu
Kết quả điê ̣n di sản phẩm của 7 set phản ƣ́ng PCR đa mồi đi ̣nh týp huyết thanh phế cầu đƣơ ̣c thể hiê ̣n ở Hình 3.3.
Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm của 7 set PCR đi ̣nh týp huyết thanh phế cầu
PC: là hỗn hợp chứng dương của các týp huyết thanh có trong set phản ứng
Kết quả có 309 mẫu phế cầu đã đƣợc thực hiện định týp huyết thanh và có 11 loại týp huyết thanh đƣợc phát hiện với tổng số 266 lần đƣợc xác định (261 mẫu đƣợc định týp , trong đó có 5 mẫu mang 2 týp huyết thanh ) và 48 mẫu không định đƣợc týp. Nhƣ vậy tổng số chủng bao gồm xác định đƣơ ̣c và không xác địnhđƣợc týp huyết thanh là 314 (266 và 48). Trong số 11 loại týp huyết thanh đƣợc phát hiện đó , những týp nổi trội nhất gồm 6A/B với 35,35% (111/314), 19F với 22,61% (71/314), 23F với 11,15% (35/314), 14 với 6,05% (19/314) và non-typable (không định đƣợc týp) chiếm 15,53% (48/309), ngồi ra cịn một tỷ lệ nhỏ các týp khác [Bảng 3.2; Biểu đồ 3.1]. Các týp huyết thanh nổi trội đƣợc phát hiện đờng thời cũng là những týp có
trong vắc xin bao gồm 6A/B, 19F, 23F, 14 và 19A, kết quả cho thấy tỷ lệ bao phủ của vắc xin PCV13 chiếm 77,07% (khơng có sự khác biệt với tỷ lệ 75,16% của PCV7 và PCV10) [Biểu đồ 1].
Tình trạng có nhiều hơn 1 týp huyết thanh đồng thời đƣợc mang trong mũi họng của mô ̣t ngƣời đã đƣợc báo cáo nhiều trƣớc đây . Kết quả định týp huyết thanh có 5/309 (1,62%) số mẫu đƣợc xác định là mang 2 týp huyết thanh [Bảng 3.2; Hình 3.4]. Trong đó có 2 mẫu mang 2 týp 6A/B + 19F, 1 mẫu mang 6A/B + 23F, 1 mẫu mang 19F + 23F, 1 mẫu mang 19F + 19A. Và cả 5 mẫu có sự đồng cƣ trú này đều thuộc nhómtrẻ dƣới 5 tuổi. Quan sát thấy, týp 19F là týp phổ biến nhất (4/5) của phế cầu thƣờng có sự đồng cƣ trú với các týp huyết thanh khác.
Xác định týp huyết thanh n (%) Mô tả
Týp huyết thanh
6A/B 19F 23F 14 19A 15B/C 23A 11 34 10A 35B
Mẫu đa týp huyết thanh
6A/B + 19F 6A/B + 23F 19F + 23F 19F + 19A 261/309 111/314 (35,35) 71/314 (22,61) 35/314 (11,15) 19/314 (6,05) 6/314 (1,91) 7/314 (2,23) 6/314 (1,91) 6/314 (1,91) 3/314 (0,96) 1/314 (0,32) 1/314 (0,32) 5/309 (1,62) 2/5 (40%) 1/5 (20%) 1/5 (20%) 1/5 (20%) Số chủng đƣợc xác địnhtýp huyết thanh
Mẫu mang 2 týp huyết thanh
Không xác đi ̣nh được týp
cpsA+ cpsA- 48/309 (15,53) 13/48 (27,08) 35/48 (72,92) Chủng không xác định đƣợc týp Chủng hiếm gặp hoặc khơng có primer Chủng khơng có vỏ hoặc hiếm gặp
Hình 3.4: Mẫu phế cầu mang 2 týp huyết thanh
Mẫu 1 và 2: 6A/B + 19F Mẫu 3: 6A/B + 23F Mẫu 4: 19F+23F
Có 48/309 (15,53%) số mẫu phế cầu không xác định đƣợc týp huyết thanh [Bảng 3.2]. Trong số này có 35/48 (72,92%) có kết quả sàng lọc với cpsA âm tính và 13/48 (27,08%) có kết quả sàng lọc với cpsA dƣơng tính. So sánh với kết quả sàng lọc cho thấy, trong phạm vi nghiên cứu này , toàn bộ 35 chủng phế cầu âm tính với cpsA đều khơng xác định đƣợc týp huyết thanh , và đa phần những chủng không xác định đƣợc týp huyết thanh thì âm tính với cpsA(72,92%). Những chủng không xác đi ̣nh đƣơ ̣c týp có thể đƣợc lí giải là do những chủng đó bản thân khơng có vỏ hoặc là những chủng hiếm gặp và/hoặc mang những tý p huyết thanh không thể xác định bởi các primer đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này.
Biểu đồ 3.1: Sự phân bố týp huyết thanh phế cầu ở trẻ em mắc ARI
3.3. Kết quả xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC)
Hình 3.4 cho thấy hình ảnh phế cầu mọc trên đ ĩa thạch Mueller -Hinton có kháng sinh. Giá trị MIC của một k háng sinh đối với một mẫusẽ đƣơ ̣c tính tại nồng độ mẫu phế cầu đó bắt đầu bi ̣ ƣ́c chế sinh trƣờng, cịn ≤ 3 kh̉n la ̣c [Hình 3.5-B].
Hình 3.5: Chủng mọc trên các đĩa thạch có nồng độ kháng sinh khác nhau
Tất cả các chủng còn sống sót (A); và một số chủng đã bị ức chế sinh trưởng (B)
Phế cầu không nhạy với phần lớn các kháng sinh đƣợc thử nghiệm. Những kháng sinh có tỷ lệ phế cầu không nhạy cao gồm Penicillin(99,17%), Ampicillin (90,91%), Cefuroxime (76,86%), Imipenem (78,51%), Macrolide (Erythromycin 90,91%; Clarithromycin 93,39%), Chlindamycin (76,86%), Ciprofloxacin (100%).Mặc dù cùng có độ khơng nhạy cao, nhƣng tỷ lệ kháng trung gian và kháng của phế cầu đối với từng loại kháng sinh lại rất khác biệt.Các kháng sinh Penicillin, Ampicillin có tỷ lệ phế cầu kháng trung gian cao hơn nhiều tỷ lệ kháng. Hầu hết những kháng sinh cịn lại có tỷ lệ phế cầu kháng cao hơn hẳn tỷ lệ kháng trung gian. Kháng sinh thế hệ mới nhất là Carbapenem (Imipenem) cũng đã xuất hiện tỷ lệ kháng