Thành phần tinh dầu trong lá Bạch đàn chiếm khoảng 5% theo khối lƣợng (đối với lá Bạch đàn tƣơi). Thành phần 1,8 – Cineole trong tinh dầu có sự khác nhau về hàm lƣợng, tùy thuộc vào đặc tính của từng loài mà hàm lƣợng này sẽ dao động trong khoảng 80 – 90% theo khối lƣợng tinh dầu tổng. Hàm lƣợng tinh dầu này cũng có thể khác nhau do ảnh hƣởng bởi các điều kiện nhƣ giống, khả năng sinh trƣởng của lá, thời tiết và thời gian thu hoạch. Trong số các tinh dầu, tinh dầu Bạch đàn có nhiều hữu ích do chúng dễ dàng chiết tách để sử dụng thƣơng mại (giá trị công nghiệp) và triển khai trên quy mơ lớn với các đặc tính có giá trị mong muốn. Theo truyền thống, tinh dầu Bạch đàn đƣợc sử dụng trong các công thức dƣợc phẩm, mỹ phẩm và cho mục đích làm sạch hộ gia đình. Tinh dầu Bạch đàn dùng để bào chế các chế phẩm dƣợc yêu cầu phải chứa ít nhất 70% 1,8 - Cineole. Các dƣợc phẩm chứa tinh dầu Bạch đàn đƣợc sử dụng để trị ho, cảm lạnh, làm giảm các cơn đau cơ bắp, chống nhiễm trùng da trong y học, nhƣ một dung mơi, chất làm kín ống tủy nha khoa. Ngồi ra cịn có ứng dụng tạo mùi thơm trong xà phòng, chất tẩy rửa, nƣớc hoa, tạo hƣơng vị. Nó cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ một chất nổi trong ngành khai thác mỏ. Hoạt tính trừ cơn trùng của tinh dầu Bạch đàn do các thành phần nhƣ
1,8-Cineole, Citronellal, Citronellol, Citronellyl acetate, p-cymene, Eucamalol, limonene, Linalool, -pinene, -terpinene, -terpineol, Alloocimene và
Aromadendrene [19]. Một số hợp chất chính trong tinh dầu Bạch đàn có khả năng
diệt trừ cơn trùng khi tách chiết từ các loại Bạchđàn khác nhau (bảng 1.3).
Bảng 1.2. Thành phần chính của tinh dầu tách chiết từ một số loài Bạch đàn
STT Lồi bạch đàn Thành phần chính Tác giả
1 E. camaldulensis Eucamalol Watanabe và cộng sự, 1993
2 E. citriodora Citronella Ramezani và cộng sự, 2002
3 E. globulus 1,8-Cineole Yang etal, 2004
4 E. grandis α-Pinene, 1,8-cineole Lucia etal, 2007
5 E. robusta α-Pinene Sartorelli và cộng sự, 2007
6 E. urophylla γ-Terpin Su và cộng sự, 2006
7 E. urophylla Alloocimene,α-pinene Liu etal, 2008
Tinh dầu Bạch đàn có hoạt tính nhƣ một loại thuốc trừ cơn trùng tự nhiên để chống lại muỗi và các loài chân đốt gây hại hoặc một vài loài động vật ăn cỏ. Tinh dầu của loài Bạch đàn xanh (E.globulus) với hợp chất chính là 1,8 - Cineole [47] có tính độc chống lại chấy hại da đầu Pediculus humanus capitis. Hoạt tính trừ chấy
rận của tinh dầu Bạch đàn tốt hơn cả delta - phenothrin hoặc pyrethrum. Giá trị
LT50 của tinh dầu Bạch đàn là 0,125 mg/cm2, trong khi đó của delta-phenothrin là
0,25 mg/cm2 [19].
Có nhiều báo cáo [13] đã chỉ ra khả năng bảo vệ các hạt ngũ cốc bị xâm nhập khi lƣu trữ bởi các lồi cơn trùng. Trên thực tế ngƣời dân sống ở các đảo xa bờ, khi vận chuyển hay lƣu trữ các hạt ngũ cốc ngƣời ta thƣờng rải các lớp lá bạch đàn trên, dƣới và xung quanh để bảo vệ hạt ngũ cốc khỏi các loài mọt, bọ. Thành phần 1,8 - Cineole trong tinh dầu loài Ocimum kenyense đƣợc tìm thấy ở vùng cao Kenya và phía bắc Tanzania có độc tính cao với bọ cánh cứng (prostephenus truncates), mọt thóc (Sitophilus granaries), mọt hại ngô (S. zeamais), mọt đỏ (Tribolium
castaneum), chúng bị diệt chết 100% với 0,5 µL 1,8 - Cineole trên 1 kg hạt sau 24
giờ. 1,8 - Cineole cũng ức chế hoàn toàn sự phát triển của trứng, ấu trùng, nhộng của mọt thóc (Sitophilus granaries) và mọt ngơ (S. zeamais). Tại liều lƣợng cao 1,8 - Cineole gợi lên một sự diệt trừ mạnh mẽ đối với mọt thóc (Sitophilus granaries)
và mọt ngơ (S. zeamais) nhƣng chỉ ở mức độ trung bình đối với mọt đỏ và bọ cánh cứng (prostephenus truncates). Khi 1,8 - Cineole chiếm 0,5% khối lƣợng trong chế độ ăn của ấu trùng mọt đỏ (Tribolium castaneum) ở giai đoạn đầu thì tỷ lệ chết là 100% sau 8 ngày. Hoạt tính ức chế mọt ngô bị giảm khi khơng có 1,8 - Cineole trong hỗn hợp. Loài bọ cánh cứng Acanthoscelides obtectus, một loài bọ cánh cứng ăn và sống ở nơi bảo quản các loại đậu, khi tiếp xúc với hơi của tinh dầu bạch đàn sẽ bị diệt và giảm mạnh khả năng sinh sản, giảm tỷ lệ nở của trứng, tỷ lệ chết của ấu trùng con [40].
Khi nghiên cứu trên các con ong mật tây [13], hợp chất chứa 1,8 - Cineole diệt đƣợc 96,7% loại chí lớn (Varroa jacobsonii), 1,8 - Cineole cũng có hoạt tính chống lại lồi mạt bụi nhà, nhện cám hay rệp Tyrophagus putrescentiae, tinh dầu Bạch đàn cho hiệu quả tốt nhất khi tiêu diệt 100% ở nồng độ thử nghiệm đối với các loài bét ký sinh trên gia súc.
1,8 - Cineole ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của ngơ, lúa mì, cỏ linh lăng, cỏ trâu (crabgrass) và rơm rạ, còn đối với đồng phân cấu trúc tự nhiên của 1,8 - Cineole là 1,4 - Cineole ức chế hoàn tồn sự nảy mầm của lúa mì, cỏ trâu, rơm rạ. Khi so sánh hiệu quả của cả hai chất thì cho thấy 1,4 - Cineole ức chế nghiêm trọng sự phát triển của rễ và chồi cịn 1,8 - Cineole thì ức chế sự phát triển của rễ, giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt, dữ liệu phân bào chỉ ra rằng 1,8 - Cineole ức chế ở tất cả các giai đoạn của q trình ngun phân trong khi đó 1,4 - Cineole chỉ ức chế giai đoạn phân bào [19]. Từ đấy cho thấy tiềm năng ứng dụng của tinh dầu Bạch đàn là một hợp phần diệt trừ cỏ dại thân thiện với môi trƣờng.
Mặc dù cơ chế hoạt động diệt côn trùng của 1,8 - Cineole vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng nhƣng có thể giải thích một cách có thể chấp nhận đƣợc là do ức chế enzyme acetylcholinesterase, con đƣờng xâm nhập vào cơ thể của côn trùng chủ
yếu là qua đƣờng hơ hấp. Các hóa chất chiết xuất từ thực vật chẳng hạn nhƣ tinh dầu Bạch đàn chứa 1,8 - Cineole, cung cấp một nguồn hóa chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đối với cây trồng, sâu bệnh và các vi khuẩn. Các hợp chất này có thể là hợp phần trong thuốc diệt cỏ dại hiệu quả, kiểm sốt dịch hại từ cơn trùng, giảm
thiểu đƣợc sự truyền nhiễm của các vi khuẩn mà không gây ô nhiễm tới môi trƣờng thiên nhiên. Nhƣng các hợp chất 1,8 - Cineole hay 1,4 - Cineole có trong tinh dầu Bạch đàn đều rất biến động, nên để sử dụng thì phải giảm biến động đó. Do đó thế hệ mới của thuốc trừ sâu tự nhiên trong tƣơng lai có thể sẽ thay thế loại thuốc trừ sâu tổng hợp để xua đuổi côn trùng gây hại, ngăn không cho chúng xâm nhập vào các hạt ngũ cốc đƣợc lƣu trữ mà không gây ảnh hƣởng và độc hại tới ngƣời sử dụng bởi các chất bảo quản.
1.4.3.2. Dịch chiết từ bã hạt Jatropha
Cây Jatropha curcas L, thuộc chi Jatropha, họ thầu dầu. Chi Jatropha có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), ám chỉ công dụng làm thuốc của cây này. Curcas là tên gọi thông thƣờng của cây physicnut ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông dụng ở các nƣớc hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây cọc dậu,.... Jatropha là một lồi cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, đƣợc ngƣời Bồ Đào Nha đƣa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang Châu Phi, Châu Á, sau đó đƣợc trồng ở nhiều nƣớc, trở thành cây bản địa ở khắp các nƣớc nhiệt đới, cận nhiệt đới trên toàn thế giới.
Từ năm 1991, Giáo sƣ ngƣời Đức là Klause Becker của Trƣờng Đại học Stuttgart đã nhận đơn đặt hàng của Tập đoàn Daimler Chrysler hợp tác với một hãng tƣ vấn của Áo tiến hành nghiên cứu cây Jatropha ở Nicaragua, để làm nguyên liệu sản xuất diesel sinh học, từ đó dấy lên cơn sốt Jatropha trên phạm vi tồn cầu [5]. Jatropha vốn dĩ là một cây dại, bán hoang dại mà ngƣời dân các nƣớc trồng chỉ để làm bờ rào và làm thuốc, nhƣng với những phát hiện mới của khoa học, đã cho thấy Jatropha có tiềm lực giá trị cực kỳ to lớn, đƣợc đánh giá rất cao, thậm chí đã có những lời ca ngợi có phần quá đáng, nhƣng dù sao Jatropha vẫn là một loại cây hết sức quý giá mà loài ngƣời phải quan tâm khai thác tốt những giá trị sinh học của cây này. Sau khi ép dầu, bã khơ dầu có hàm lƣợng Nitơ (4,14-4,78%), P2O5 (0,5 - 0,66%), CaO (0,60-0,65%), MgO (0,17-0,21%) đƣợc sử dụng làm phân hữu cơ rất
tốt để bón cho các loại cây trồng, đặc biệt vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch, vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì của đất.
Hạt của cây Jatropha chứa một số thành phần độc hại (Phorbol este trong hạt Jatropha), có thể đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học [24]. Dịch chiết lấy ra từ hạt có hiệu quả chống lại các mối Odontotermes obesus (Rambur). Các Phorbol este của Jatropha cũng cho thấy là có hiệu quả chống lại các mối. Tỷ lệ tử vong 100% đã đạt đƣợc trong 6 h với dịch chiết Jatropha và trong 12 giờ với hợp chất Phorbol ester [24].
Các kiểu gen của Jatropha là S.zeamais và R.dominica đều có tác dụng độc hại với côn trùng [35]. Trong các nghiên cứu trƣớc đây, độc tính của Jatropha là do các hợp chất độc hại với thuộc tính của cơn trùng, chẳng hạn nhƣ Phorbol este [33], [24]. Các hợp chất này thƣờng đƣợc tìm thấy trong thực vật Euphorbiaceae, chủ
yếu trong chi Jatropha, nồng độ của Phorbol estecó thể thay đổi theo đặc tính di truyền của cây [24]. Tuy vậy, độc tính của hai kiểu gen S.zeamais và R.dominica là không khác nhau [35]. Tỷ lệ tử vong của côn trùng cao hơn khi sử dụng dịch chiết lấy từ hạt so với dịch chiết đƣợc lấy từ vỏ, lá, rễ của cây Jatropha. Hiệu quả của thuốc diệt côn trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, tuy nhiên với thuốc trừ sâu thực vật, dựa vào các hoạt động côn trùng khác nhau mà thay đổi thành phần của dịch chiết và cách tổng hợp thuốc khác nhau để tiêu diệt chúng một cách triệt để [35].
Trong dịch chiết từ bã hạt Jatropha chứa hợp chất Phorbol ester, đây là cấu tử rất quan trọng và có độc tính diệt cơn trùng. Việc xác định đƣợc sự có mặt của hợp chất này rất quan trọng đảm bảo hoạt tính tiêu diệt cơn trùng của vi nhũ tƣơng đƣợc tổng hợp.
Hình 1.5. Công thức của Phorbol etster
Theo nghiên cứu của các tác giả [25] đã xác định đƣợc hoạt tính sinh học của Phorbol ester nhƣ: chất kích thích gây ung thƣ, gây cản trở đến hoạt động trao đổi chất của tế bào, hoạt chất các tiểu cầu, giảm phân tế bào lympho, ức chế tiết sữa, chứng viêm gây ung thƣ da, sản sinh prostaglandin và kích thích chống kết dính trong các bạch cầu trung tính.
Nhờ những hoạt tính sinh học của Phorbol ester các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu độc tính của nó trên các động vật gây hại nhƣ chuột, mọt, ốc, sâu bệnh,… đã cho thấy khả năng gây chết hiệu quả.
Độc tính của Phorbol ester trong dịch chiết từ bã hạt Jatropha cũng đã đƣợc nghiên cứu trên mọt ngô, mọt đục hạt nhỏ, mọt thóc cho thấy phản ứng độc tính và khả năng gây chết đối với các loại mọt không khác nhau nhiều. Khả năng diệt mọt cách cứng của dịch chiết từ hạt Jatropha khi kết hợp với tinh dầu bạch đàn cũng đƣợc nghiên cứu [36]. Từ những phân tích và nhận định trên cho thấy đƣợc khả năng kháng sâu bệnh và các động vật gây hại của Phorbol ester có trong dịch chiết từ bã hạt Jatropha, vì vậy có thể phát triển dịch chiết từ bã hạt Jatropha làm thuốc trừ sâu sinh học trong bảo quản thóc giống.
1.4.3.3. Hệ vi nhũ tương tinh dầu Bạch đàn và dịch chiết từ bã hạt Jatropha
Cũng nhƣ các hệ vi nhũ khác hệ vi nhũ tinh dầu Bạch đàn và dịch chiết từ bã hạt Jatropha gồm có pha dầu là tinh dầu Bạch đàn, dịch chiết từ bã hạt Jatropha, chất hoạt động bề mặt cịn pha liên tục là nƣớc, ngồi ra cịn có thể có thêm chất đồng hoạt động bề mặt khác.
Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu hệ nhũ tƣơng tinh dầu Bạch đàn và dịch chiết từ bã hạt Jatropha. Hệ nhũ tƣơng tinh dầu Bạch đàn cùng với dịch chiết từ bã hạt Karanja và Jatropha có hoạt tính chống cơn trùng [36]. Nhũ tƣơng nano tinh dầu Bạch đàn tẩm chitosan có tác dụng kháng khuẩn chống lại tác nhân gây bệnh lâm sàng là vi khuẩn Staphylococcus arureus (một loài tụ cầu khuẩn
Gram - dƣơng kị khí) khi thực nghiệm trong ống nghiệm [41]. Nhũ hóa bằng phƣơng pháp sóng siêu âm tinh dầu Bạch đàn có tính kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng hay tụ cầu khuẩn (Staphylococcus arureus) và hoạt tính chữa lành vết thƣơng ở chuột Wistar [42].
Hoạt tính chống sâu bệnh của tinh dầu Bạch đàn đã bị chi phối bởi các hợp phần hóa học: hợp phần tỷ lệ và các loại terpenes. Việc khảo sát thành phần dầu để đƣa ra hoạt tính bên trong dầu và giúp việc thiết lập ảnh hƣởng của các hợp phần khác nhau. Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính trừ sâu chống ruồi cho thấy hợp phần hóa học chủ yếu của dầu E. globulus là 1,8-Cineole (33.6%), α-pinene
(14,2%) và D-limonene (10,1%) còn phần hơi của dầu E. glolulus xác định qua quá trình vi chiết pha rắn, phân tích cho thấy 1,8-Cineole (56,5%), α-pinene (16,9%) và
D-limonene (5,5%) và Linaloacetate (3,4%) là những hợp phần cơ bản. Hoạt tính
chống sâu bệnh của dầu E.globulus đƣợc đánh giá là trừ ấu trùng và nhộng của ruồi, thơng qua 2 thí nghiệm sinh học khác nhau: độc tính truyền nhiễm và trừ sâu. Thí nghiệm về độc tính truyền nhiễm với ấu trùng cho thấy nồng độ để tiêu diệt côn trùng, LC50 trong khoảng 2,73 và 0,6 µl/cm2 đối với các ngày quan sát khác nhau trong khi đó thời gian chết, LT50 thay đổi trong khoảng 6 và 1,7 ngày. Trong thử nghiệm chất phun đối với đối ấu trùng ruồi, các giá trị LC50 là 66,1 và 50,1 µl/l thu đƣợc tƣơng ứng trong 24h và 48 h [44].
Chƣơng 2- THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Tổng hợp vi nhũ tƣơng từ tinh dầu Bạch đàn và dịch chiết từ bã hạt Jatropha. - Sƣ̉ du ̣ng vi nhũ tƣơng tạo ra để phịng , diệt cơn trùng trong bảo quản thóc giống.
2.2. Đối tƣợng, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Tinh dầu Bạch đàn, dịch chiết từ bã hạt Jatropha.
- Chế phẩm sinh học dạng vi nhũ tƣơng. Chế phẩm bảo quản có thể sử dụng làm thí nghiệm trong vịng 1-6 tháng. Chế phẩm đƣợc nghiên cứu với mục đích gây độc làm chết mọt ở giai đoạn trƣởng thành.
- Thƣ̉ n ghiê ̣m khả năng phòng và diê ̣t trƣ̀ mọt đục hạt nhỏ (Rhizopertha dominica) của vi nhũ tƣơng.
2.2.2. Nguyên liệu, hóa chất
- Hạt Jatropha có xuất xứ từ Bình Thuận.
- Nƣớc cất, đƣợc lấy tại Phịng thí nghiệm Bộ mơn Lọc - Hóa dầu, trƣờng Đại Học Mỏ - Địa Chất.
- n-hexan, xuất xứ Trung Quốc.
- Propylene Glycol (PG), xuất xứ Singapore.
- Tinh dầu Bạch đàn thƣơng phẩm (Tinh dầu Bạch đàn Khánh Linh) mua tại Công ty TNHH thƣơng mại và dịch vụ Mỹ Long, địa chỉ: số 3, ngõ 15, phố Trần Nhật Duật, phƣờng Quang Trung, Hà Đông, Hà Nội, điện thoại: 046254158- 01665388382.
- TWEEN 80 (HLB = 15) hay Polyoxyethylene sorbitan monooleate, xuất xứ từ Trung Quốc.
- Thóc làm thức ăn ni mọt (mọt đục hạt nhỏ), đƣợc lấy tại BM thuốc, cỏ dại và Môi trƣờng - Viện Bảo vệ Thực vật.
2.2.3. Dụng cụ
- Hệ chiết soxhlet (bình 2 cổ, sinh hàn đứng, ống tuần hồn hay ống đựng mẫu cần chiết).
- Bếp khấy từ gia nhiệt, tủ sấy, bình hút chân khơng.
- Bình chiết, phễu, giấy lọc, pipet 3ml và 10ml, bình tam giác có nắp đậy, đũa thủy tinh, cốc thủy tinh, nhiệt kế 0-1000C.
- Hộp nhựa (cao 11,5 cm, đƣờng kính 9 cm), chậu nhựa (cao 20 cm, đƣờng kính 70 cm), xơ nhựa, khay nhựa, bút lơng, thìa inox, panh, giấy lọc, đĩa petri, máy đo nhiệt độ, máy ảnh.
- Các dụng cụ khác.
2.3. Quy trình tạo ra dịch chiết Jatropha từ bã hạt Jatropha.
2.3.1. Quy trình chiết tách tinh dầu từ hạt Jatropha.
Để tách tinh dầu từ hạt Jatropha thƣờng sử dụng hai phƣơng pháp: ép cơ học