1.3.1. Thực vật học
Quần đầu khỉ là lồi thực vật có hoa thuộc họ Na (Annonaceae). Lồi này được Buch Ham. Ex Hook. F. et. Thomson Benth miêu tả khoa học đầu tiên năm 1862 với tên gọi Polyalthia simiarum Benth. Hook. f.
Cây gỗ trung bình, cao 15-20 m, vỏ cây màu trắng xám, nhánh non có lơng mịn. Lá có phiến bầu dục, dài 15-18 cm, rộng 5-8 cm, khơng lơng, trừ ở gân chính; mặt dưới nâu đỏ; gân bên 15-17 đôi; cuống lá dài 6-8 mm, khơng có lơng. Hoa xếp thành xim bó 2-4 cái ở nhánh già; cánh hoa hẹp, dài đến 4 cm, thường tiếp tục phát triển; nhị nhiều; lá nỗn khơng lơng. Quả khơng lơng, có cuống dài; hạt đơn, màu xám, nhẵn. Cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5, có quả từ tháng 5 đến tháng 7 [1,4].
Cây mọc rải rác trong rừng ở các vùng khí hậu nhiệt đới, tập trung ở Đơng Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Myanmar; ngồi ra cịn có ở Butan, Ấn Độ, Trung Quốc. Tại Việt Nam cây được tìm thấy nhiều ở Đồng Nai (Biên Hòa) [1,4].
1.3.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Theo kinh nghiệm dân gian phần vỏ của cây Quần đầu khỉ thường được sử dụng. Ở Ấn Độ, vỏ của cây được dùng làm thuốc trị bị cạp đốt.
Trên thế giới mới có duy nhất một cơng trình nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum). Kết quả cho thấy: vỏ ở thân cây cây chứa một loại bisnor clerodane diterpenoid mới là 2-oxo-14,15-bisnor- 3,11E-kolavadien-13 (145), và ba dẫn xuất clerodane đã biết trước đây, acid kolavenic (146); 16β-hydroxycleroda-3,13(14)Z-dien-15,16-olide (147) và 16- oxocleroda-3,13(14)E-dien-15-oic acid (148) [58].
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu cây Quần đầu khỉ được thu hái ngày 12/9/2013 tại Sơ Pai-K’Bang-Gia Lai gồm 2 bộ phận lá và vỏ. Mẫu đã được TS. Nguyễn Quốc Bình-Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định tên khoa học là Polyalthia simiarum (Quần đầu khỉ) thuộc chi Polyalthia, họ Annonaceae. Mẫu tiêu bản VN 1751 được lưu tại Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu
Vỏ cây được thái nhỏ, lá để nguyên. Các bộ phận này được phơi riêng trong bóng râm cho đến khơ, sấy ở nhiệt độ 50oC - 55oC rồi nghiền nhỏ. Mẫu dưới dạng bột khô được ngâm chiết theo quy trình chung. Chiết bằng phương pháp ngâm mẫu ở nhiệt độ phòng trong metanol 4 lần, 24h/lần. Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết MeOH cô đặc. Từ dịch chiết metanol này sẽ điều chế các cặn chiết với các dung mơi có độ phân cực tăng dần theo phương pháp chiết phân bố.
2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật
Để phân tích và phân tách các cặn chiết của cây cũng như phân lập các chất sạch nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký rây phân tử (sephadex LH-20).
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhơm tráng sẵn silicagel 60 F254 của Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol.
Sắc ký cột thường với pha tĩnh là silicagel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-
400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như:
n-hexan/diclometan, n-hexan/etyl axetat, n-hexan/axeton, diclometan/metanol,
…với tỉ lệ thích hợp.
Sắc ký sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi metanol hoặc hỗn hợp metanol/diclometan (9:1, 8:2, …).
2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ các mẫu thực vật nghiên cứu
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp của các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phương pháp phổ khối phun bụi điện tử
(ESI-MS), phổ khối ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI-MS) và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY).
Độ quay cực của các hợp chất được đo bằng máy Jasco P-2000 của hãng Jasco Mỹ và điểm nóng chảy được đo trên máy MEL TEMP 3.0 của hãng Thermo Scientific-Mỹ tại Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
2.5.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của
Monks.
2.5.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck và McKane L. & Kandel. Các chủng vi sinh vật kiểm định được hoạt hóa và pha lỗng tới nồng độ khoảng 0,5 đơn vị Mc Fland. Các phiến thí nghiệm để trong tủ ấm ở 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ cho nấm. Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ 5-10 thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM
3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia
simiarum)
3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết xuất
Lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum) sau khi thu hái được phơi khơ trong bóng râm và sấy ở nhiệt độ 50-55oC trong vòng 2h. Lá cây khô (1,54 kg) được nghiền thành bột mịn rồi ngâm chiết trong MeOH (4 lần, 24h/lần). Gộp các dịch chiết MeOH lại với nhau, cất loại dung mơi xuống cịn khoảng 1/15 thể tích ban đầu. Pha lỗng dịch chiết còn lại bằng nước cất, chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan và etyl axetat. Làm khô các dịch chiết bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi để thu được các cặn chiết tương ứng n-hexan (PSH; 4,0 g), etyl
axetat (PSE; 10,0 g) và metanol (PSM; 13,5 g). Phần bã sau khi ngâm chiết bằng MeOH tiếp tục được ngâm với dung dịch HCl 1,5% (10 lít) trong vòng 24h. Lọc lấy phần nước, thêm dung dịch NaOH 5% cho đến khi pH đạt 9-10. Gạn bớt phần nước ở trên, chiết phần nước có chứa tủa còn lại bằng CH2Cl2 (3 lần, 300 ml/lần). Gom các dịch chiết CH2Cl2 và cất loại dung môi thu được cặn chiết alkaloit (PSA; 1,3 g).
Hàm lượng các cặn chiết được tính theo cơng thức:
Trong đó:
H%: hàm lượng cặn thu được mc: khối lượng cặn thu được (g)
mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g)
Như vậy, hàm lượng các cặn chiết thu được lần lượt là: cặn n-hexan
(0,26%), etyl axetat (0,65%), metanol (0,84%), alkaloit (0,084%).
H% = mc
Dưới đây là quy trình xử lý và chiết xuất các cặn từ lá cây Quần đầu khỉ:
Sơ đồ 3.1. Quá trình chiết xuất lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)
Bột lá khô (1,54 kg)
Ngâm chiết với MeOH (4 lần, 24h/lần)
Dịch Metanol
1. Cất loại MeOH xuống cịn 1/15V 2. Pha lỗng bằng nước cất
3.
Dịch MeOH - H2O
5. Ngâm với dung dịch HCl 1,5% (10 , 24h)
6. Lọc lấy nước, thêm dung dịch NaOH đến pH 9-10 7. Chiết bằng CH2Cl2, cất loại dung môi.
8. Cặn chiết n-hexan (PSH; 4,0 g) Cặn chiết EtOAc (PSE; 10,0 g) Cặn MeOH (PSM; 13,0 g) Phần bã Cặn ancaloit (PSA; 1,3 g)
1. Chiết phân bố với n-hexan 2. Chiết phân bố với EtOAc
3. Làm khô dịch chiết, cất loại dung môi 4.
3.1.2. Phân lập chất từ các cặn chiết của lá cây Quần đầu khỉ
Phân tách cặn chiết alkaloit (PSA; 1,3 g) trên cột silicagel, rửa giải theo phương pháp gradient hệ dung mơi CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH) thu được 5 nhóm phân đoạn A1-A5. Tinh chế nhóm phân đoạn A3 (30 mg) trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi MeOH thu được 3 phân đoạn A3.1-A3.3. Phân đoạn A3.2 (9,8 mg) có chất kết tinh, rửa phân đoạn này bằng axeton và kết tinh lại phần chất rắn trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS3 (4 mg).
Sơ đồ 3.2. Quá trình phân lập các chất từ cặn alkaloit
Cặn chiết etyl axetat (PSE; 10,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng phương pháp gradient hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (0→ 20% MeOH) để thu được 5 phân đoạn E1-E5.
Phân đoạn E4 tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (9:1) thu 5 phân đoạn, E4.1-E4.5. Sau khi cất loại hết dung môi ở phân đoạn E4.3 thu được chất rắn màu vàng, kết tinh lại trong hỗn hợp n-hexan/CH2Cl2 (1:1) thu được chất QDK1 (9,5 mg).
Phân đoạn E5 và E6 sau khi cất loại hết dung môi thu được chất rắn màu vàng, rửa chất rắn này bằng axeton thu được chất rắn màu trắng, kết tinh lại trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS5 (2,2 g).
Cặn alkaloit (PSA) (1,3 g)
CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH)
A1 300 mg A2 150 mg A3 30 mg A4 100 mg A5 200 mg Sephadex LH-20
dung môi MeOH
A3.1 10 mg Rửa bằng axeton Kt. axeton/CH2Cl2 A3.2 9.8 mg A3.3 7 mg POS3 4 mg
Sơ đồ 3.3. Quá trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat
Cặn MeOH (PSM; 13,0 g) được phân tách trên cột diaion HP-20, rửa cột lần lượt với 100% H2O, H2O/MeOH (1:1) và 100% MeOH để thu được 3 phân đoạn M1-M3. Phân đoạn M3 (4,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2) để thu được 3 nhóm phân đoạn M3.1-M3.3. Sau khi cất loại lần lượt hết dung mơi ở nhóm phân đoạn M3.2 và M3.3 thu được hai chất rắn màu vàng. Kết tinh lại các chất rắn này trong hỗn hợp MeOH/H2O lần lượt thu được các chất POS1 (35,0 mg) và POS2 (20,0 mg).
Cặn etyl axetat (PSE) (10,0 g)
CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH)
E1 1,9 g E2 1,5 g E3 1,3 g E4 1,7 g E5 1,4 g CC, Silica gel, CH2Cl2/MeOH (9:1) E4.2 0,3 g Kt. CH2Cl2/MeOH E4.3 50 mg E4.4 0,5 g E6 1,7 g E7 0,8 g E4.1 0,5 g QDK1 9,8 mg POS5 2,2 g Rửa bằng axeton Kt. CH2Cl2/MeOH
Sơ đồ 3.4. Quá trình phân lập các chất từ cặn metanol 3.1.3. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập
Indole-3-carbaldehyde (QDK1): Tinh thể hình kim, khơng màu, nóng chảy
ở 180-181oC. 1H-NMR (500 MHz, MeOD) H ppm: 7,25 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz,
H-5); 7,29 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, d, J=7,5 Hz, H-7); 8,11 (1H, s, H-2); 8,17 (1H, d, J=7,5 Hz, H-4); 9,90 (1H, s, 3-CHO). 13C-NMR (500 MHz, MeOD) C ppm: 113,12 (C-7), 120,13 (C-3); 122,38 (C-4); 123,61 (C-5); 124,99 (C-6); 125,72 (C-9); 138,94 (C-8); 139,67 (C-2); 187,40 (-CHO) (xem Bảng 4.3).
1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline (POS3): Tinh thể
khơng màu, nóng chảy ở 186-187oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) H ppm: 2,54 (3H, s, N-CH3); 2,86 (4H, s, 2H-3 và 2H-4); 3,68 (2H, s, H-1); 6,98 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,05 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-7); 7,28 (1H, br d, J=8,0 Hz, H-8); 7,40 (1H, br d; J=8,0 Hz, H-5). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) C ppm: 53,19 (C- 1); 54,12 (C-3); 22,19 (C-4); 107,60 (C-4a); 128,27 (C-4b); 118,46 (C-5); 119,70 (C-6); 121,95 (C-7); 111,81 (C-8); 137,99 (C-8a); 132,44 (C-9a); 45,61 (N-CH3). ACPI-MS: 203 [M+H]+ (xem Bảng 4.4).
Rutin (POS2) (Quercetin-3-O-rutinoside): Tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 214-215oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.1).
Cặn metanol (PSM) (13,0 g)
CC, Diaion HP-20, 100% H2O, 50% MeOH, 100% MeOH
M1 M2 2,3 g M3 4,0 g CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2) M3.1 1,5 g M3.2 0,12 mg M3.3 0,10 mg POS1 35 mg POS2 20 mg Rửa, kết tinh lại
Kaempferol-3-O-rutinoside (POS1): Tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 162-164oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.2).
3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia
simiarum)
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Mẫu vỏ cây Quần đầu khỉ tươi được thái nhỏ, phơi khô, sấy ở 50-55oC trong 2-3h, sau đó xay thành bột thu được 1,8 kg. Nguyên liệu dưới dạng bột (1,8 kg) được ngâm chiết với MeOH bốn lần (5 lít/lần, 24h/lần). Gộp các dịch chiết lại và cất loại bớt dung mơi dưới áp suất giảm đến cịn khoảng 1/15 thể tích ban đầu. Pha lỗng dịch chiết metanol đã cơ đặc bằng nước cất theo tỉ lệ 1/1. Sau đó tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, etyl axetat, mỗi dung môi chiết 3 lần (500ml/lần). Gộp dịch chiết của 3 lần và làm khô bằng Na2SO4 khan. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là n-hexan (7,5 g), etyl axetat (13,6 g), metanol (16,5 g).
Sơ đồ 3.5. Quá trình chiết xuất vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)
Bột vỏ cây khô (1,8 kg)
Ngâm chiết với MeOH (4 lần, 24h/lần)
Dịch Metanol
1. Cất loại MeOH xuống cịn 1/15V 2. Pha lỗng bằng nước cất
3.
Dịch MeOH - H2O
1. Chiết phân bố với n-hexan 2. Chiết phân bố với EtOAc
3. Làm khô dịch chiết, cất loại dung môi 4. Cặn n-hexan (PVH; 7,5 g) Cặn EtOAc (PVE; 13,6 g) Cặn MeOH (PVM; 16,5 g)
Hàm lượng cặn n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng là: 0,42%,
0,75% và 0,92%.
Cặn n-hexan (PVH; 7,5 g) được phân tách sơ bộ bằng phương pháp sắc ký
cột trên chất hấp phụ silicagel thường với hệ dung môi rửa giải gradient
n-hexan/axeton (0→100%) thu được các phân đoạn từ VH1-VH5.
Phân đoạn VH1 được tinh chế qua cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/axeton (100:0, 99:1) thu 3 phân đoạn VH1.1-VH1.3. Rửa phân
đoạn VH1.2 bằng axeton và kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi
n-hexan/axeton (7:3) thu được chất SP1 (0,35 g).
Phân đoạn VH3 được kết tinh trong CH2Cl2/MeOH (9/1) thu được chất có Rf trùng với POS5 (50 mg).
Cặn n-Hexan ( PVH; 7,5 g)
CC, silica gel, n-hexan/Axeton (0→100% A)
VH1 0,32 g VH2 1,96 g VH3 1,02 g VH4 2,54 g VH5 1,2 g CC, silica gel, 100 % n-hexan, n-hexan/axeton (99:1) VH1.1 50 mg VH1.2 0,2 g VH1.3 50 mg SP1 35 mg POS5 50 mg Kết tinh trong CH2Cl2/MeOH POS6 10 mg Rửa bằng MeOH
Sơ đồ 3.6. Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexan 3.2.2. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập
Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1): tinh thể hình kim, không
màu. Nhiệt độ nóng chảy 112-113oC. [α]D25 +67.5 (MeOH, c 0,62). 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.5). ESI-MS m/z: 305 [M+H]+
β-sitosterol (POS5): Tinh thể dạng phiến, màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 135-136oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.6).
Sitosterol-3-O-β-glucopyranoside (POS6): Chất rắn dạng vơ định hình,
màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 273-274oC.
3.3. Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất đƣợc phân lập các chất đƣợc phân lập
3.3.1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu thử.
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) và Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis (ATCC 11774) và Staphylococcus aureus
subsp. Aureus (ATCC 11632)
- Nấm sợi: Aspergillus niger (439) và Fusarium oxysporum (M42)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae
(SH 20)
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane L. & Kandel (1996).
- Chứng dương tính là Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+), tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-) và Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.
- Chứng âm tính là vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mơi trường duy trì và bảo tồn giống là Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma) cho nấm men và nấm mốc, và Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) cho vi khuẩn. Mơi trường thí nghiệm là Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn và Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng đọ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
+ Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
- Tính kết quả: Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị ức chế gần như hoàn toàn. Mẫu thơ có MIC ≤ 200 µg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.
3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào
a) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM