Phân tách cặn chiết alkaloit (PSA; 1,3 g) trên cột silicagel, rửa giải theo phương pháp gradient hệ dung mơi CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH) thu được 5 nhóm phân đoạn A1-A5. Tinh chế nhóm phân đoạn A3 (30 mg) trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi MeOH thu được 3 phân đoạn A3.1-A3.3. Phân đoạn A3.2 (9,8 mg) có chất kết tinh, rửa phân đoạn này bằng axeton và kết tinh lại phần chất rắn trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS3 (4 mg).
Sơ đồ 3.2. Quá trình phân lập các chất từ cặn alkaloit
Cặn chiết etyl axetat (PSE; 10,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng phương pháp gradient hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (0→ 20% MeOH) để thu được 5 phân đoạn E1-E5.
Phân đoạn E4 tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (9:1) thu 5 phân đoạn, E4.1-E4.5. Sau khi cất loại hết dung môi ở phân đoạn E4.3 thu được chất rắn màu vàng, kết tinh lại trong hỗn hợp n-hexan/CH2Cl2 (1:1) thu được chất QDK1 (9,5 mg).
Phân đoạn E5 và E6 sau khi cất loại hết dung môi thu được chất rắn màu vàng, rửa chất rắn này bằng axeton thu được chất rắn màu trắng, kết tinh lại trong hốn hợp CH2Cl2/MeOH thu được chất POS5 (2,2 g).
Cặn alkaloit (PSA) (1,3 g)
CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH)
A1 300 mg A2 150 mg A3 30 mg A4 100 mg A5 200 mg Sephadex LH-20
dung môi MeOH
A3.1 10 mg Rửa bằng axeton Kt. axeton/CH2Cl2 A3.2 9.8 mg A3.3 7 mg POS3 4 mg
Sơ đồ 3.3. Quá trình phân lập các chất từ cặn etyl axetat
Cặn MeOH (PSM; 13,0 g) được phân tách trên cột diaion HP-20, rửa cột lần lượt với 100% H2O, H2O/MeOH (1:1) và 100% MeOH để thu được 3 phân đoạn M1-M3. Phân đoạn M3 (4,0 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2) để thu được 3 nhóm phân đoạn M3.1-M3.3. Sau khi cất loại lần lượt hết dung mơi ở nhóm phân đoạn M3.2 và M3.3 thu được hai chất rắn màu vàng. Kết tinh lại các chất rắn này trong hỗn hợp MeOH/H2O lần lượt thu được các chất POS1 (35,0 mg) và POS2 (20,0 mg).
Cặn etyl axetat (PSE) (10,0 g)
CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH (0→20% MeOH)
E1 1,9 g E2 1,5 g E3 1,3 g E4 1,7 g E5 1,4 g CC, Silica gel, CH2Cl2/MeOH (9:1) E4.2 0,3 g Kt. CH2Cl2/MeOH E4.3 50 mg E4.4 0,5 g E6 1,7 g E7 0,8 g E4.1 0,5 g QDK1 9,8 mg POS5 2,2 g Rửa bằng axeton Kt. CH2Cl2/MeOH
Sơ đồ 3.4. Quá trình phân lập các chất từ cặn metanol 3.1.3. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập
Indole-3-carbaldehyde (QDK1): Tinh thể hình kim, khơng màu, nóng chảy
ở 180-181oC. 1H-NMR (500 MHz, MeOD) H ppm: 7,25 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz,
H-5); 7,29 (1H, dt, J=1,0; 7,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, d, J=7,5 Hz, H-7); 8,11 (1H, s, H-2); 8,17 (1H, d, J=7,5 Hz, H-4); 9,90 (1H, s, 3-CHO). 13C-NMR (500 MHz, MeOD) C ppm: 113,12 (C-7), 120,13 (C-3); 122,38 (C-4); 123,61 (C-5); 124,99 (C-6); 125,72 (C-9); 138,94 (C-8); 139,67 (C-2); 187,40 (-CHO) (xem Bảng 4.3).
1,2,3,4-tetrahydro-9-hydroxy-2-methyl-β-carboline (POS3): Tinh thể
khơng màu, nóng chảy ở 186-187oC. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) H ppm: 2,54 (3H, s, N-CH3); 2,86 (4H, s, 2H-3 và 2H-4); 3,68 (2H, s, H-1); 6,98 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-6); 7,05 (1H, td, J=1,0; 8,0 Hz, H-7); 7,28 (1H, br d, J=8,0 Hz, H-8); 7,40 (1H, br d; J=8,0 Hz, H-5). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) C ppm: 53,19 (C- 1); 54,12 (C-3); 22,19 (C-4); 107,60 (C-4a); 128,27 (C-4b); 118,46 (C-5); 119,70 (C-6); 121,95 (C-7); 111,81 (C-8); 137,99 (C-8a); 132,44 (C-9a); 45,61 (N-CH3). ACPI-MS: 203 [M+H]+ (xem Bảng 4.4).
Rutin (POS2) (Quercetin-3-O-rutinoside): Tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 214-215oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.1).
Cặn metanol (PSM) (13,0 g)
CC, Diaion HP-20, 100% H2O, 50% MeOH, 100% MeOH
M1 M2 2,3 g M3 4,0 g CC, silica gel, CH2Cl2/MeOH/H2O (8:2:0,2) M3.1 1,5 g M3.2 0,12 mg M3.3 0,10 mg POS1 35 mg POS2 20 mg Rửa, kết tinh lại
Kaempferol-3-O-rutinoside (POS1): Tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 162-164oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.2).
3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia
simiarum)
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Mẫu vỏ cây Quần đầu khỉ tươi được thái nhỏ, phơi khô, sấy ở 50-55oC trong 2-3h, sau đó xay thành bột thu được 1,8 kg. Nguyên liệu dưới dạng bột (1,8 kg) được ngâm chiết với MeOH bốn lần (5 lít/lần, 24h/lần). Gộp các dịch chiết lại và cất loại bớt dung mơi dưới áp suất giảm đến cịn khoảng 1/15 thể tích ban đầu. Pha lỗng dịch chiết metanol đã cơ đặc bằng nước cất theo tỉ lệ 1/1. Sau đó tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, etyl axetat, mỗi dung môi chiết 3 lần (500ml/lần). Gộp dịch chiết của 3 lần và làm khô bằng Na2SO4 khan. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là n-hexan (7,5 g), etyl axetat (13,6 g), metanol (16,5 g).
Sơ đồ 3.5. Quá trình chiết xuất vỏ cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)
Bột vỏ cây khô (1,8 kg)
Ngâm chiết với MeOH (4 lần, 24h/lần)
Dịch Metanol
1. Cất loại MeOH xuống cịn 1/15V 2. Pha lỗng bằng nước cất
3.
Dịch MeOH - H2O
1. Chiết phân bố với n-hexan 2. Chiết phân bố với EtOAc
3. Làm khô dịch chiết, cất loại dung môi 4. Cặn n-hexan (PVH; 7,5 g) Cặn EtOAc (PVE; 13,6 g) Cặn MeOH (PVM; 16,5 g)
Hàm lượng cặn n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng là: 0,42%,
0,75% và 0,92%.
Cặn n-hexan (PVH; 7,5 g) được phân tách sơ bộ bằng phương pháp sắc ký
cột trên chất hấp phụ silicagel thường với hệ dung môi rửa giải gradient
n-hexan/axeton (0→100%) thu được các phân đoạn từ VH1-VH5.
Phân đoạn VH1 được tinh chế qua cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/axeton (100:0, 99:1) thu 3 phân đoạn VH1.1-VH1.3. Rửa phân
đoạn VH1.2 bằng axeton và kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi
n-hexan/axeton (7:3) thu được chất SP1 (0,35 g).
Phân đoạn VH3 được kết tinh trong CH2Cl2/MeOH (9/1) thu được chất có Rf trùng với POS5 (50 mg).
Cặn n-Hexan ( PVH; 7,5 g)
CC, silica gel, n-hexan/Axeton (0→100% A)
VH1 0,32 g VH2 1,96 g VH3 1,02 g VH4 2,54 g VH5 1,2 g CC, silica gel, 100 % n-hexan, n-hexan/axeton (99:1) VH1.1 50 mg VH1.2 0,2 g VH1.3 50 mg SP1 35 mg POS5 50 mg Kết tinh trong CH2Cl2/MeOH POS6 10 mg Rửa bằng MeOH
Sơ đồ 3.6. Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexan 3.2.2. Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất đã phân lập
Ent-halima-1(10),13E-dien-15-oic acid (SP1): tinh thể hình kim, khơng
màu. Nhiệt độ nóng chảy 112-113oC. [α]D25 +67.5 (MeOH, c 0,62). 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.5). ESI-MS m/z: 305 [M+H]+
β-sitosterol (POS5): Tinh thể dạng phiến, màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 135-136oC. 1H-NMR và 13C-NMR (xem Bảng 4.6).
Sitosterol-3-O-β-glucopyranoside (POS6): Chất rắn dạng vơ định hình,
màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 273-274oC.
3.3. Hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất đƣợc phân lập các chất đƣợc phân lập
3.3.1. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu thử.
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) và Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis (ATCC 11774) và Staphylococcus aureus
subsp. Aureus (ATCC 11632)
- Nấm sợi: Aspergillus niger (439) và Fusarium oxysporum (M42)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae
(SH 20)
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane L. & Kandel (1996).
- Chứng dương tính là Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+), tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-) và Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.
- Chứng âm tính là vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mơi trường duy trì và bảo tồn giống là Saboraud Dextrose Broth (SDB-Sigma) cho nấm men và nấm mốc, và Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) cho vi khuẩn. Mơi trường thí nghiệm là Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn và Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng đọ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
+ Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
- Tính kết quả: Các mẫu được pha lỗng theo các thang nồng độ thấp dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị ức chế gần như hồn tồn. Mẫu thơ có MIC ≤ 200 µg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.
3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào
a) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
b) Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt
TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của
Monks [9,20,39,41,54]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay
96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml; 0,16 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi
trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử nhưng có TBUT (180 l) sẽ
được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid-TCA.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thơng qua công thức sau:
% ức chế = 100% - % sống sót
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thơ, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.
CHƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Quần đầu khỉ (Polyalthia simiarum)
Từ các cặn chiết của lá cây Quần đầu khỉ đã phân lập được 04 hợp chất sau:
4.1.1. Rutin (POS2)
Chất POS2 nhận được dưới dạng chất kết tinh dạng kim màu vàng chanh đặc trưng của một flavonoit. Các phổ NMR của hợp chất này cho thấy đây là một flavon-glycozit.
Phổ 1H-NMR (Hình 4.1) của POS2 xuất hiện các tín hiệu của 5 proton
vịng thơm trong đó có hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau [δ 6,23 và 6,42 (1H, d, J=2,0 Hz)] và 3 proton còn lại được xác định thuộc vào một vịng
thơm có hệ tương tác ABX [δ 7,69 (1H, d, J=2,0 Hz); 6,89 (1H, d, J=8,5 Hz); 7,64 (1H, dd, J=2,0; 8,5 Hz)]. Các dữ kiện phổ trên cho phép dự đốn sự có mặt của cấu trúc khung flavonoit dạng quercetin. Sự xuất hiện của các proton anome tại δ 5,12 (1H, d, J=7,5 Hz) và 4,54 (1H, d, J=1,5 Hz) xác định sự tồn tại của hai phân tử đường. Ngồi ra, sự xuất hiện các tín hiệu của một nhóm oximetilen tại δ 3,83 (1H, dd, J=11,0 và 1,0 Hz, Ha) và 3,41 (1H, dd, J=11,0 và 6,0 Hz, Hb), và một nhóm metyl bậc hai tại δ 1,13 (3H, d, J=6,5 Hz), cùng với giá trị hằng số tương tác của các proton anome tương ứng cho phép dự đốn sự có mặt của đường β-D-
glucopyranose và α-L-rhamnopyranose trong phân tử.
Phổ 13C-NMR (Hình 4.2) của POS2 xuất hiện tín hiệu của 27 cacbon trong đó có 15 cacbon thuộc khung flavon và 12 cacbon thuộc vào hai phân tử đường. Giá trị độ chuyển dịch hóa học của các cacbon của phân tử đường thứ nhất xuất hiện tại δ 104,71 (C-1”); 75,72 (C-2”); 78,19 (C-3”); 71,40 (C-4”); 77,22 (C-5”); 68,55 (C-6”) khẳng định đây là đường β-D-glucopyranose. Các giá trị độ dịch
chuyển hóa học của cacbon của đơn vị đường còn lại tại δ 102,41 (C-1”’); 72,10 (C-2”’); 72,25 (C-3”’); 73,94 (C-4”’); 69,70 (C-5”’); 17,86 (C-6”’) xác định đơn vị đường α-L-rhamnopyranose. Sự tăng mạnh độ chuyển dịch hóa học của cacbon oximetilen C-6’’ ( 68,55) của đơn vị đường glucose cho phép xác định vị trí liên kết của đường rhamnose tại cacbon này.
Các tương tác trên phổ HSQC và HMBC đưa đến nhận định, chất này có thể là rutin.
Từ các phân tích trên, số liệu phổ 13C-NMR của POS2 được so sánh với giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất rutin. Sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR giữa hai hợp chất (bảng1) cùng với sự có mặt của pic giả ion phân tử [M+Na]+ tại m/z 633 trên phổ ESI-MS tương ứng với công thức phân tử là
C27H30O16 cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của POS2 là quercetin-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside], chất này còn được gọi là
quercetin-3-O-rutinoside hay rutin
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của POS2
C #C DEPT Ca,b Ha,c
(m, J=Hz) 2 158,52 C 158,52 - 3 135,62 C 135,62 - 4 179,44 C 179,41 - 5 162,98 C 162,98 - 6 99,95 CH 99,97 6,23 (d, 2,0) 7 166,01 C 166,09 - 8 94,87 CH 94,88 6,42 (d, 2,0) 9 159,35 C 159,33 - 10 105,66 C 105,61 - 1’ 123,15 C 123,13 - 2’ 117,69 CH 117,69 7,69 (d, 2,0) 3’ 145,84 C 145,84 - 4’ 149,81 C 149,80 - 5’ 116,06 CH 116,06 6,89 (d, 8,5) 6’ 123,55 CH 123,55 7,64 (dd, 2,0; 8,5) 1” 104,69 CH 104,71 5,12 (d, 7,5) 2” 75,74 CH 75,72 3,49 (dd, 7,7; 9,0) 3” 78,20 CH 78,19 3,43 (t, 9,0) 4” 71,42 CH 71,40 3,30 (t, 9,0) 5” 77,25 CH 77,25 3,35 (m) 6” 68,56 CH2 68,55 3,83 (dd, 1,0; 11,0) 3,41 (dd, 6,0; 11,0) 1’” 102,42 CH 102,41 4,54 (d, 1,5) 2’” 72,12 CH 72,10 3,65 (dd, 1,5; 3,2) 3’” 72,26 CH 72,25 3,55 (dd, 3,2; 9,5) 4’” 73,94 CH 73,94 3,32 (m) 5’” 69,71 CH 69,70 3,47 (m) 6’” 17,87 CH3 17,86 1,13 (d, 6,5)
ađo trong metanol-d4, b
125MHz, c500MHz, m: multiplicity, #C của rutin.
4.1.2. Kaempferol-3-O-rutinoside (POS1)
Chất POS1 cũng nhận được dưới dạng chất kết tinh hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 161-162oC. Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của POS1 rất giống với phổ của POS2. Phổ 1H-NMR của POS1 xuất hiện các tín hiệu của 6 proton vịng thơm trong đó có hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau [(δ 6,24 và 6,43; (1H, d, J=2,0 Hz)] và 4 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm thế 2 lần ở vị trí para [δ 8,08 (2H, d, J=9,0 Hz); 6,91 (2H, d, J=9,0 Hz)]. Các dữ kiện phổ này cho phép dự đốn sự có mặt của cấu trúc khung flavonoit dạng kaempferol. Tương tự như POS2, trên phổ 1
H-NMR xuất hiện các proton anome tại δH 5,14 (1H, d, J=7,5 Hz) và 4,53 (1H, d, J=1,5 Hz), một nhóm oximetilen tại δ 3,82 (1H, dd, J=11,0 và 1,5 Hz, Ha)/3,44 (1H, dd, J=11,0 và 6,0 Hz, Hb), và một nhóm metyl bậc hai tại δ 1,13 (3H, d, J=6,5 Hz) cho phép dự đốn sự có mặt của
đường β-D-glucopyranose và α-L-rhamnopyranose trong phân tử của POS1. Phổ