Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.2.3.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase
Phản ứng kiểm tra sự ức chế enzyme được thực hiện theo phương pháp McCue và cs (2005) với sự thay đổi sau [25]. 20 l enzyme (0,5 U/ml) được hòa
vào 120 l đệm phosphat 0,1M, pH 6,9. Tiếp theo, 10 l mẫu (hòa trong DMSO ở các nồng độ mẫu khác nhau) được bổ sung vào dịch enzyme nói trên và ủ trong 15 phút. Sauđó, 20 l cơ chất p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (5mM) được bổ
sung vào các giếng và ủ 15 phút tại 37C. Enzyme thủy phân cơ chất, giải phóng chất p-nitrophenol hấp thụ bước sóng A405nm tạo màu vàng.
Bổ sung 80 l sodium carbonate 0.2M vào mỗi giếng để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng (control) được làm tương tự sử dụng 10 l nước cất thay mẫu.
Cường độ quang được đo tại bước sóng A405nm. Đối chứng dương (positive control) sử dụng voglibose làm chất ức chế. Mỗi thí nghiệm lặp lại 2-3 lần. Tỉ lệ ức chế enzyme của mẫu được tính theo cơng thức sau đây:
Ức chế (%) = [(Acontrol – Amẫu)/ Acontrol]*100
2.2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH
DPPH là gốc oxi hóa tự do bền với phổ hấp phụ tại 515 nm. Chất này bị giảm hấp thụ bước sóng khi bị khử bởi chất chống oxi hóa hay chất bao vây gốc tự do. Phương pháp DPPH được sử dụng rộng rãi để xác định hoạt tính chống oxi hóa/bao vây gốc tự do.
Phương pháp theo tác giả Shalaby và cs (2013) với một số thay đổi [27]. Quy trình như sau: 10 l cao chiết tại các nồng độ thử khác nhau được hòa với 190 l
chất DPPH (200 uM, trong metanol). Sau khi ủ 30 phút trong bóng tối tại nhiệt độ thường, phiến 96 giếng được đo bước sóng tại A515 nm. Phản ứng được lặp lại 2 lần và hoạt tính chống oxi hóa được tính theo cơng thức :
% ức chế= [(A control- Atest)/A control *100%.
Trong đó: A: giá trị đo; Acontrol là bước sóng của dịch DPPH. A test: giá trị của mẫu cao chiết.
2.2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào
Tế bào ung thư được ni hoạt hóa 2 lần/tuần trong môi trường MEME (minimum essential medium with Eagle’s salt) bổ sung L-glutamin, sodium
piruvate, NaHCO3, PSF (penicillim – streptomycin sulffat – fungizone); NAA (non- essential amino acids); 10% BCS (bovine calf serum) , trong 5% CO2 tại 37oC.
Tế bào 2 ngày tuổi được rửa bằng PBS và làm bong bằng trypssin (0,05%) trong 5 phút tại 37oC. Môi trường nuôi cấy được bổ sung để hịa lỗng tế bào đến nồng độ 3-4×104cell/ml. 190 l dịch tế bào được nhỏ vào các giếng mà trước đã bổ sung 10 l dịch cao chiết trong 10% DMSO. Đối chứng dương, ellipticine tại các giá trị khác nhau được sử dụng thay mẫu. Phiến được ủ tại 37oC trong 5% CO2 trong 72 giờ.
Sau 3 ngày nuôi, 100 l 50% TCA được bổ sung mỗi giếng, và ủ tại 4oC trong 1giờ. Mỗi giếng được bổ sung 100 L 0,4% sulforhodamin B (SRB) và đảo nhẹ, để 30 phút nhiệt độ phòng và tiếp theo rửa bằng axetic acid 1% 3 lần để loại bỏ chất nhuộm khơng bám. Sau đó, 200 l Tris pH 10,5 (10mM) được bổ sung vào
các giếng và lắc nhẹ trong 5 phút. Độ hấp thụ được đo tại A540nm và đọc bằng máy đọc phiến 96 giếng. Tỉ lệ % tế bào sống được tính theo cơng thức:
Sống sót (%): = 100% * (A test – A dayO)/(A neg control – OD day0). % ức chế = 100% - % sống sót.