Stt Ký hiệu mẫu Bao vây gốc DPPH* (tại 100 g/mL) Giá trị SC50 (g/mL)* 1 HN32 62,1 63,2 2 HN21 75,2 39,2 3 HN8 86,2 28,1 4 HN3 55,7 84,9
5 HN33 91,1 15,1
6 HN30 66,1 79,5
7 HN41 72,1 52,5
8 HN66 75,1 69,2
9 HN11 66,2 85,2
* SC50: nồng độ mẫu bao vây 50% gốc tự do (đo bước sóng A515nm)
Bảng 3.3 cho thấy, mẫu có hoạt tính tốt là HN33, thể hiện ở giá trị SC50 thấp nhất, đạt 15,1 g/ml. Vì vậy, mẫu nấm này được chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Đặc điểm khuẩn lạc của mẫu HN33 được mô tả như sau: Khuẩn lạc có màu trắng, giữa hơi nâu hồng, xốp, sắc tố tiết hồng được thể hiện tại hình 3.9.
Hoạt tính chống oxi hóa có ở một số nấm nội sinh ở rong như Acremonium sp., Aspergillus ochraceus, A. wentiti, Chaetomium glolosum, Epicoccum sp. và
nhiều hoạt chất từ các nấm này đã được xác định [9].
Hình 3.9. Khuẩn lạc nấm HN33
3.3.4. Vị trí phân loại của các chủng vi sinh vật
Hình 3.10 cho thấy, cặp mồi EF4f/EF3r nhân gene 18S rDNA đặc hiệu, sản phẩm là 1 băng duy nhất, với kích thước đúng như dự kiến ~1,5 kb. Sản phẩm PCR đã được gửi đi giải trình tự.
Hình 3.10. Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi EF4f/EF3r nhân gene
18S rRNA của nấm HN22, HN37 và HN33
3.3.5. Xây dựng cây phát sinh loài
Sau khi trình tự 18S rDNA được giải, chúng tôi kiểm tra phổ bằng phần mềm bioedit (Hình 3.11) và lựa chọn các đoạn trình tự có chất lượng để tiếp tục phân tích, ghép nối 2 trình tự (ngược và xi chiều) thành trình tự trọn vẹn (>1330 bp) để tiến hành xây dựng cây phát sinh loài nấm.
Nấm HN37
Đoạn 18S rDNA dài 1330 bp được so sánh với trình tự trong ngân hàng gene NCBI. Từ trình tự của nấm sợi HN37 và các trình tự tương đồng trong ngân hàng gene, cây phát sinh lồi nấm đó được xây dựng.
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng nấm HN37 dựa trên trình tự 18S rDNA, sử dụng
phần mềm MEGA7, phương pháp Neighbor Joining, giá trị Bootstrap sử dụng là 500 Theo kết quả BLAST với các trình tự 18S rDNA của các loài nấm đã biết, trình tự của chủng HN37 có sự tương đồng cao với các chủng nấm sau:
+ Tương đồng 99% với: Chaetomium globosum strain WFWML4, Fusarium
equiseti strain PF10 , Trichocladium asperum strain DFVB10 ;Chaetomium elatum ; Myceliophthora hinnulea strain ATCC 52474 ; Myceliophthora fergusii
strain CBS 405.69 và tương đồng với các loài nấm đã biết khác, như Metarhizium anisopliae strain ARSEF 1066 (95%); Acremonium potronii strain CBS
416.68(95%), Sagenomella oligospora (95%); Annulusmagnus triseptatus strain
CBS 128831 (96%), Beauveria bassiana isolate DAOM216540 (96%).
Nấm HN22
JQ964323.1 Chaetomium globosum strain WFWML4 MF522214.1 Fusarium equiseti strain PF10
HN37
AY706334.1 Humicola grisea var. grisea strain DAOM 232586 JQ067910.1 Remersonia thermophila strain ATCC 22073 AF527811.1 Madurella mycetomatis
KT587332.1 Myceliophthora verrucosa NG 062672.1 Humicola fuscoatra var. fuscoatra DQ471021.1 Bombardia bombarda
XR 898033.1 Neurospora crassa OR74A DQ470989.1 Camarops ustulinoides
KP776994.1 Coniochaeta velutina AJ496246.1 Lecythophora lignicola
AB048282.1 Ascotricha lusitanica gene for 18S rRNA partial sequence AB220233.1 Nigrospora oryzae
AJ301942.1 Colletotrichum trifolii AB268359.1 Nomuraea rileyi
FJ609308.1 Metarhizium anisopliae strain ARSEF 1066 AF141949.1 Fusarium equiseti 18S ribosomal RNA gene partial sequence
KU512835.1 Fusarium oxysporum strain YuZhu1 JN236216.1 Gibberella intermedia isolate CA3-1 HM165488.1 Gibberella fujikuroi strain SH-f13 HM165488.1 Gibberella fujikuroi strain SH-f13(2)
100 100 96 94 58 49 97 71 97 97 77 58 90 46 49 41 77 0.0050
Hình 3.12. Cây phát sinh chủng nấm HN22 dựa trên trình tự 18S rDNA, sử dụng phần
mềm MEGA7, phương pháp Neighbor Joining, giá trị bootstrap sử dụng là 500 Chủng HN22 có độ tương đồng 18S rDNA cao (99%) với nhiều chủng nấm đã biết, trong đó có nhiều lồi thuộc chi Penicilium, Aspergillus.
Cụ thể, trình tự 18S rDNA tương đồng 99% với các loài đã biết như sau:
Tương đồng 99% với các nấm: Penicillium sp. R57; Penicillium janthinellum; Penicillium herquei; Penicillium oxalicum; và các loài thuộc chi Penicillium. Ngoài ra, độ tương đồng 99% với các loài thuộc chi khác như: Eladasaccula MC-ARA-1.5; Chromocleista sp 12F; Thysanophor apenicillioides
NRRL 31511; Aspergillus awamori SB6; Aspergillus terreus; Talaromyces byssochlamydoides; Byssochlamys nivea CBS100.11; Eurotium amstelodami và
một số chi khác.
Như vậy, trình tự 18S rDNA của 2 nấm trên có độ tương đồng cao (99%) với nhiều trình tự của các lồi, chi nấm khác nhau. Theo nhiều cơng bố, khi mà 2 trình tự barcoding có độ tương đồng cao 96% có thể chúng cùng một loài hoặc ngược
HN22
EF413620.1 Eupenicillium javanicum isolate AFTOL-ID 429 LC092115.1 Penicillium expansum
HQ263114.1 Eladia saccula strain MC-ARA-L5
GU733347.1 Monascus eremophilus AB008406.1 Hemicarpenteles ornatus
KT832781.1 Aspergillus terreus strain ISSFR-002 GU733342.1 Xeromyces bisporus EU263606.1 Eurotium herbariorum strain TPID14 HQ871900.1 Penicillium decumbens strain s1821 AB023950.1 Talaromyces byssochlamydoides
EF468714.1 Thermomyces lanuginosus strain ATCC 200065 NG 062802.1 Talaromyces flavus var. flavus CBS 310.38
AB003952.1 Chromocleista cinnabarina AB015788.1 Aphanoascus cinnabarinus L28066.1 Malbranchea gypsea
XR 001551858.1 Paracoccidioides lutzii Pb01
EF631623.1 Trichophyton verrucosum strain BMU03357 AY177295.1 Kraurogymnocarpa trochleospora
AJ315169.1 Gymnoascus reesii
AB015775.1 Gymnascella hyalinospora
42 95 67 53 82 100 99 61 48 100 53 52 87 25 45 86 27 32 0.0050
lại, hai trình tự có độ tương đồng 100% vẫn có thể là hai lồi khác nhau Do vậy, tạm thời chúng tôi chưa thể xác định chính xác 2 chủng trên thuộc chi hoặc lồi nào. Để phân loại chi tiết hơn, các nấm này cần nghiên cứu thêm bao gồm: giải trình tự gene ITS (internal transcribed spacer) (gene nằm giữa 18S và 28S rDNA); và các nghiên cứu về hình thái bào tử, đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng.
KẾT LUẬN
1. 125 vi khuẩn và 164 nấm (nấm men và sợi) được phân lập từ 33 mẫu rong biển. Trong đó, 35 chủng vi khuẩn và 35 chủng nấm được lên men (500 ml/chủng) và 70 cao chiết được thu với mỗi loại > 5mg.
2. Đã thử nghiệm hoạt tính: (i) ức chế enzyme -glucosidase, (ii) gây độc 3
dòng tế bào ung thư người (HEP-G2, RD và LU) và (iii) khả năng bao vây gốc tự do DPPH*. Có 5 chủng nấm ức chế -glucosidase, 10 chủng gây độc tế bào ung thư cao (khả năng sống sót 0-19,39%, tại 100 g/L), và 9 chủng có hoạt tính bao vây
gốc tự do DPPH* với SC50 từ 15,1 đến 85,2 g/mL.
3. Đã giải trình tự 18S rDNA của chủng nấm HN37 (ức chế -glucosidase) và
HN22 (gây độc 3 dòng tế bào ung thư). Chủng HN37 có độ tương đồng 18S rDNA 99% với một số lồi thuộc chi Fusarium; Trichocladium. Chủng HN22 có độ tương đồng 18S rDNA cao 99% với một số chi: Chromocleista, Penicilium, Aspergillus. Đã xây dựng cây phát sinh loài của 2 trình tự 18S rDNA của nấm HN37 và HN22 sử dụng phần mềm MEGA7.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý N. M. C. và cs (2007) “Phân lập và đặc điểm của fucoidan từ năm loài rong mơ ở miền Trung,” Tạp chí Hóa học, vol.
45, no. 3, pp. 339–343.
2. Bengtsson M., Sjøtun K., Øvreås L. (May 2010) “Seasonal dynamics of bacterial biofilms on the kelp Laminaria hyperborea,” Aquat. Microb. Ecol.,
vol. 60, no. 1, pp. 71–83.
3. Burke C., Thomas T., Lewis M., Steinberg P., Kjelleberg S. (Apr. 2011) “Composition, uniqueness and variability of the epiphytic bacterial community of the green alga Ulva australis,” ISME J., vol. 5, no. 4, pp. 590–600.
4. Butardo V., Ganzon-Fortes E., Silvestre V., Bacano-Maninga M., Montano M., et al. (2003) “Isolation and classification of culturable bacteria associated with ice-ice disease in Kappaphycus and Eucheuma (Rhodophyta, Solieriaceae),” Philipp. Sci., vol. 40, pp. 223–237.
5. Croft M. T., Warren M. J., Smith A. G. (2006) “Algae Need Their Vitamins †,” Eukaryot. Cell, vol. 5, no. 8, pp. 1175–1183.
6. Egan S. et al (2012). The seaweed holobiont: understanding seaweed- bacteria interactions. 37(3): 462 – 476.
7. Engel C. R., Valero M., Lagadeuc Y., Destombe C. (2002) “Non-random mating in controlled multiple-donor crosses in Gracilaria gracilis (gracilariaceae, rhodophyta),” Eur. J. Phycol., vol. 37, no. 2, pp. 179–190. 8. Fernandes N., Case R. J., Longford S. R., Seyedsayamdost M. R., Steinberg
P. D., et al. (2011) “Genomes and virulence factors of novel bacterial pathogens causing bleaching disease in the marine red alga Delisea pulchra,”
9. Flewelling A. J., Currie J., Gray C. A., Johnson J. A. (2015) “Endophytes from marine macroalgae: Promising sources of novel natural products,” Curr.
Sci., vol. 109, no. 1, pp. 88–111.
10. Goecke F., Labes A., Wiese J., Imhoff J. (Jun. 2010) “Chemical interactions between marine macroalgae and bacteria,” Mar. Ecol. Prog. Ser., vol. 409,
pp. 267–299.
11. Gomez L.V., Mercado I.S., Rivas G.G and Sanchez N.E.A. (2010). Antibacterial and anticancer activity of seaweeds and bacteria associated with their surface. Revista de Biologia Marina y Ocenaografia 45(2): 267-275.
12. Harder T. (2008) “Marine Epibiosis: Concepts, Ecological Consequences and
Host Defence,” Springer, Berlin, Heidelberg, 2008, pp. 1–13.
13. Huỳnh Quang Năng N. H. D. (1998) “Results on transplanting Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty into the seawaters of Vietnam,” Proc. Fourth Nat. Conf. Mar. Sci. Techn., vol. 2
14. Johansen J. E., Nielsen P., Sjoholm C. (1999) “Description of Cellulophaga baltica gen. nov., sp. nov. and Cellulophaga fucicola gen. nov., sp. nov. and
reclassification of [Cytophaga] lytica to Cellulophaga lytica gen. nov., comb. nov.,” Int. J. Syst. Bacteriol., vol. 49, no. 3, pp. 1231–1240.
15. Kanagasabhapathy M., Sasaki H., Nagata S. (Oct. 2008) “Phylogenetic identification of epibiotic bacteria possessing antimicrobial activities isolated from red algal species of Japan,” World J. Microbiol. Biotechnol., vol. 24, no. 10, pp. 2315–2321.
16. Kenneth G. B., David R. A., J G. B. (1999) “Antibacterial and Repellent Activities of Marine Bacteria Associated with Algal Surfaces,” Biofouling,
vol. 14, no. jully, pp. 227–236.
17. Kharwar R. N., Mishra A., Gond S. K., Stierle A., Stierle D. (2011) “Anticancer compounds derived from fungal endophytes: Their importance and future challenges,” Nat. Prod. Rep., vol. 28, no. 7, pp. 1208–1228.
18. Kizhakkekalam V.K, and Chakraborty K. (2018). Pharmacological properties of marine macroalgae-associated heterotrophic bacteria. Archives of Microbiology. https://doi.org/10.1007/s00203-018-1592-1
19. Kumar S. A., Brown L. (Sep. 2013) “Seaweeds as potential therapeutic interventions for the metabolic syndrome,” Rev. Endocr. Metab. Disord., vol. 14, no. 3, pp. 299–308.
20. Lam C., Stang A., Harder T. (Mar. 2008) “Planktonic bacteria and fungi are selectively eliminated by exposure to marine macroalgae in close proximity,”
FEMS Microbiol. Ecol., vol. 63, no. 3, pp. 283–291.
21. Largo D. B., Fukami K., Adachi M., Nishijima T. (1997) “Direct enumeration of bacteria from macroalgae by epifluorescence microscopy as applied to the fleshy red algae Kappaphycus alvarezii and Gracilaria spp. (Rhodophyta),” J.
Phycol., vol. 33, no. 3, pp. 554–557.
22. Liu F., Pang S. (2010) “Nonculturability of the pathogenic Vibrio parahaemolyticus in live culture of Grateloupia turuturu is associated with
bacterial attachment to the algal thalli,” Acta Oceanol. Sin., vol. 29, no. 6, pp. 92–103.
23. Longford S., Tujula N., Crocetti G., Holmes A., Holmström C., et al. (Aug. 2007) “Comparisons of diversity of bacterial communities associated with three sessile marine eukaryotes,” Aquat. Microb. Ecol., vol. 48, no. 3, pp.
217–229.
24. Loque C. P., Medeiros A. O., Pellizzari F. M., Oliveira E. C., Rosa C. A., et al. (2010) “Fungal community associated with marine macroalgae from Antarctica,” Polar Biol., vol. 33, no. 5, pp. 641–648.
25. MacArtain P., Gill C. I. R., Brooks M., Campbell R., Rowland I. R. (2007) “Nutritional value of edible seaweeds,” Nutr. Rev., vol. 65, no. 12, pp. 535–543.
26. Mahadevan G., Murugan A., Mahendran S., Gautam K., Ravi V. (2013) “Antifouling activity of the green seaweed Ulva reticulata and its epiphytic bacterial,” Int. J. Advacesd Life Sci., vol. 6, no. 5, pp. 417–424.
27. Mathan S., Subramanian V., Nagamony S., Ganapathy K. (2013) “Isolation of endophytic fungi from marine algae and its bioactivity,” Int. J. Res. Pharm. Sci., vol. 4, no. 1, pp. 45–49.
28. Mccue P., Kwon Y. I., Shetty K. (2005) “Anti-amylase, anti-glucosidase and anti-angiotensin I-converting enzyme potential of selected foods,” J. Food Biochem., vol. 29, no. 3, pp. 278–294.
29. Saleem M., Ashraf M., Saleem M., Ali S., Hussain S., et al. (2013) “NPR- 2007-fungal Marine natural products of fungal origin,” Nat. Prod. Rep., no.
OCTOBER.
30. Shalaby E. A., Shanab S. M. M. (2013) “Comparison of DPPH and ABTS assays for determining antioxidant potential of water and methanol extracts of
Spirulina platensis,” Indian J. Mar. Sci., vol. 42, no. 5, pp. 556–564.
31. Solis M. J. L., Draeger S., Dela Cruz T. E. E. (2010) “Marine-derived fungi from Kappaphycus alvarezii and K. striatum as potential causative agents of ice-ice disease in farmed seaweeds,” Bot. Mar., vol. 53, no. 6, pp. 587–594. 32. Suryanarayanan T. S., Thirunavukkarasu N., Govindarajulu M. B., Gopalan
V. (2012) “Fungal endophytes: An untapped source of biocatalysts,” Fungal Divers., vol. 54, pp. 19–30.
33. Tujula N. A., Crocetti G. R., Burke C., Thomas T., Holmström C., et al. (2010) “Variability and abundance of the epiphytic bacterial community associated with a green marine Ulvacean alga,” ISME J., vol. 4, no. 2, pp. 301–311.
34. Villarreal-Gómez L. (2010) “Antibacterial and anticancer activity of seaweeds and bacteria associated with their surface,” Rev. Biol. …, vol. 45,
35. Wahl M., ShahnazL., Dobretsov S., Saha M., Symanowski F., et al. (2010) “Ecology of antifouling resistance in the bladder wrack Fucus vesiculosus:
Patterns of microfouling and antimicrobial protection,” Mar. Ecol. Prog. Ser., vol. 411, pp. 33–48.
36. Wiencke C. (2012) “Seaweed Biology Novel Insights into Ecophysiology and
Utilization Ecological Studies, Vol. 219 Analysis and Synthesis,” pp. 1–508.
37. Zheng L., Han X., Chen H., Lin W., Yan X. (2005) “Marine bacteria associated with marine macroorganisms: the potential antimicrobial resources,” Ann. Microbiol., vol. 55, no. 2, pp. 119–124.
38. Zuccaro A., Schoch C. L., Spatafora J. W., Kohlmeyer J., Draeger S., et al. (2008) “Detection and identification of fungi intimately associated with the brown seaweed Fucus serratus,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 74, no. 4, pp. 931–941.
39. Flemming H.-C., Murthy P. S., Venkatesan R., Cooksey K., Eds. (2009)
Marine and Industrial Biofouling, vol. 4. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin
VI. PHỤ LỤC