CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn
Dùng các đĩa petri có chứa mơi trƣờng Winogradsky đã khử trùng. Pha loãng các mẫu ở các nồng độ 10-1
, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5. Dùng pipet lấy 100 µl dịch mẫu đã pha lỗng cho lên mặt thạch. Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều trên mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khơ thì dừng lại. Các mẫu đã cấy gạt cho vào tủ ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng h nh thành biofilm
Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dƣ ng thích h p và môi trƣờng nuôi cấy tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện, quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào. Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp của O’Toole và cộng sự [45, 46]. Các chủng vi khuẩn đƣ c lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa mơi trƣờng LB trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bƣớc sóng 620 nm (OD620) ở vào khoảng 0,2 đến 0,3. H t 100 µl dịch ni cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 µl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy đƣ c loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trƣờng bằng phƣơng pháp so màu ở bƣớc sóng 620 nm dịch ni cấy vi khuẩn.
Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống eppendorf đƣ c rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 25 ph t ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh.
Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất khử trùng các tinh thể tím bám trên thành eppenodorf đƣơc hòa tan trong 1 ml etanol 70%. Mật độ tế bào trong biofilm đƣ c xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại
bƣớc sóng 570 nm.
Quan sát cấu tr c biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (SEM). Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch ni cấy lắc vi khuẩn vào bình tam giác chứa 20 ml môi trƣờng LB. Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37o
C.
Gắn mẫu biofilm lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đ n cồn để cố định mẫu. Rửa nhẹ bằng nƣớc cất khử trùng.
Gắn mẫu lên đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC–1200 trong 5 ph t ở 30 mA.
Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi quét điện tử JSM–5421LV (Nhật Bản) tại phòng chụp Hiển vi điện tử quét. Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên.
2.3.3. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng nuôi cấy lên sự h nh thành màng sinh học
Vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khác nhau. Nhiệt độ, pH khơng thích h p sẽ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của ch ng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ mơi trường ni cấy
Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Ảnh hưởng của pH mơi trường nicấy
Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy ở các pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 9. Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.3.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động nhƣ một hàng rào thẩm
thấu ngăn cản sự thất thốt của tím kết tinh. Ban đầu vi khuẩn đƣ c nhuộm bằng tím kết tinh sau đó đƣ c xử lý bằng iơt để tăng độ giữ màu. Sau đó đƣ c tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot đƣ c giữ lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loại lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thƣớc của lỗ. Do vậy, ở bƣớc rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kết tinh-iơt. Khi nhuộm lại bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1].
Phƣơng pháp tiến hành:
Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nƣớc lên lam kính sạch, đốt nóng que cấy trên ngọn lửa đ n cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoặc trong ống giống, đƣa vào giọt nƣớc, cố định vết bôi bằng cách hơ khô trên ngọn lửa đ n cồn.
Cho một giọt tím kết tinh bao phủ hồn tồn vết bơi, nhuộm trong thời gian 1 ph t. Sau đó rửa bằng nƣớc cất và thấm khô.
Nhuộm với lƣugôn (chứa KI và I2) tƣơng tự nhƣ với tím kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.
Nhuộm safain trong 2 ph t. Rửa bằng nƣớc cất, thấm khơ. Soi trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100 lần. Quan sát kết quả và đƣa ra kết luận.
2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ
Mỗi chủng đƣ c nuôi lắc ở 37°C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15, 20 ngày. Môi trƣờng nuôi lắc là dung dịch mơi trƣờng Winogradsky có bổ sung 1% pepton [34].
2.3.6. Phƣơng pháp phân tích nitơ tổng số
Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển tồn bộ nitơ ở cả dạng vô cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở bƣớc sóng 220 nm [9].
Phƣơng pháp làm nhƣ sau: Xử lý mẫu
Thêm 10 ml dd A (dd A : 4 g NaOH + 3 g K2S2O8)/100ml nƣớc cất. N t chặt và đun trong nồi khử trùng ở 120°C trong 30 ph t.
Sau đó lấy 30 ml mẫu vào bình định mức 50 ml, lọc loại bỏ vẩn đục. Thêm 6,5 ml HCl (HCl:H2O = 1:15 về thể tích).
Lắc và định mức tới 50 ml bằng nƣớc khử ion. Lập đƣờng chuẩn
Chuẩn bị đƣờng chuẩn gồm 4 điểm bằng bình định mức 50ml
Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,722 g KNO3 bằng nƣớc cất, sau đó định mức lên 1000 ml, đựng trong chai màu nâu, bảo quản trong tủ lạnh.
Dung dịch chuẩn 10 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc ra 10 lần Cách tiến hành: lấy thể tích dung dịch chuẩn theo tỷ lệ vào 4 bình định mức, thêm vào mỗi bình 0,5 ml dung dịch HCl, định mức tới 50 ml bằng nƣớc cất, lắc đều. Sau đó đo ở bƣớc sóng 220 nm.
Với mẫu sau khi thực hiện bƣớc xử lý mẫu xong cũng tiến hành tƣơng tự nhƣ bƣớc lập đƣờng chuẩn
Tính tốn kết quả
mgN- T = mgN-
Ch ý: giới hạn của phép đo là < 3 mg/l, nếu hàm lƣ ng nitơ trong mẫu nằm q giới hạn thì phải pha lỗng mẫu.
2.3.7. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng amoni (NH4+
)
Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn đƣ c phân tích dựa trên nồng độ amoni trong môi trƣờng theo các khoảng thời gian nuôi.
Nguyên tắc:
Phản ứng của NH4+và hypochloride với sự có mặt của x c tác phenol tạo thành h p chất indophenol blue. So màu ở bƣớc sóng 640 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Hypochloride: 15g NaOH khan + 500 ml NaClO 0,1% sau đó định mức đến 1000ml bằng nƣớc khử ion.
nitroprusside (Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O), định mức đến 500 ml bằng nƣớckhử ion.Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn đƣ c lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105°C trong 3 giờ, để nguội trong bình h t ẩm. Cân 3,819g NH4Cl, hòa tan và định mức đến 1000 ml bằng nƣớc khử ion. Dung dịch có nồng độ N- NH4+ là 1 g/l. Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc.
Lập đƣờng chuẩn: tƣơng ứng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l. Lấy 5 ml mẫu vào ống thủy tinh.
Thêm 3 ml thuốc thử phenol- sodium nitroprusside. Lắc trên máy rung 30 giây.
Thêm 3 ml hypochloride. Lắc trên máy rung 30 giây. Điều nhiệt ở 37°C trong 25 ph t. Đo ở bƣớc sóng 640 nm.
Với mẫu cũng làm các bƣớc tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chuẩn.
2.3.8. Phƣơng pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite
Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của các chủng đƣ c đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trƣờng nuôi cấy.
Nguyên tắc:
Phản ứng giữa nitrite và hỗn h p sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bƣớc sóng 540 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Dung dịch sunfanylamide: cân 0,6 g sunfanylamide hịa tan trong 50 ml nƣớc cất nóng, làm lạnh, thêm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.
Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0,1g naphtylendiamine dihydrochloride hòa tan trong 100 ml nƣớc cất, đựng trong chai màu nâu, bảo quản lâu dài ở 4o
C. Lập đƣờng chuẩn:
Hòa tan 1,23g NaNO2 trong 1000 ml nƣớc cất. Dung dịch gốc có nồng độN- NO2 là 250 mg/l.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/l bằng cách pha dung dịchgốc. Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.
Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau. Thêm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.
Trộn đều và giữ yên trong 5 ph t. Thêm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl. Trộn đều và giữ yên trong 10 ph t. So màu ở bƣớc sóng 540 nm.
Với các dung dịch mẫu làm tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chuẩn.
2.3.9. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA
Các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý nitơ đƣ c phân tích trình tự gen 16S rRNA để xác định cây phân loại.
Trình tự gen đoạn 16S rRNA đƣ c đọc trên máy đọc trình tự tự động ABIPRISM 3100 Avant (Mỹ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN
Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA đƣ c so sánh với trình tự đoạn gentƣơng tƣng của các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phƣơng pháp Clustal X. Cây phát sinh chủng loại đƣ c xây dựng dựa trên phần mềm njplot.
2.3.10. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các kết quả thu đƣ c đƣ c xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phầnmềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Vi khuẩn oxi hóa amoni 3.1. Vi khuẩn oxi hóa amoni
3.1.1. h n l p tu n chọn vi hu n oxi h a amoni
Từ các mẫu thải bị ô nhiễm amoni thu thập đƣ c, tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn sinh trƣởng đƣ c trên các môi trƣờng đặc trƣng- môi trƣờng Winogradsky 1. Các chủng vi khuẩn lựa chọn đƣ c xác định khả năng oxi hóa amoni thành nitrite.
Kết quả đã phân lập và tuyển chọn đƣ c 10 chủng vi khuẩn oxi hóa amoni đƣ c ký hiệu lần lƣ t là: BNI-1, BNI-2, BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI- 8, BNI-9, BNI-10.
Khả năng sinh trƣởng và hoạt tính của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni sau 5 ngày nuôi cấy lắc đƣ c thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng oxi hóa amoni của nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni
Chủng phân lập N-NH4 ban đầu (mg/l) N-NH4 còn lại (mg/l) N-NO2 tạo ra (mg/l) BNI-1 5 3,580,4 1,40,11 BNI-2 5 3,600,36 1,40,12 BNI-3 5 1,430,15 3,2 0,33 BNI-4 5 1,430,16 3,50,4 BNI-5 5 1,890,17 2,90,31 BNI-6 5 1,080,09 3,60,41 BNI-7 5 1,24 0,12 3,70,36 BNI-8 5 2,680,26 2,10,22 BNI-9 5 1,100,09 3,70,38 BNI-10 5 1,560,16 3,30,34
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, các chủng BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI-9 và BNI-10 có khả năng oxi hóa amoni cao hơn các chủng khác. Đặc biệt,
hiệu suất loại amoni của các chủng BNI-6, BNI-7 và BNI-9 đạt tƣơng ứng là 72%, 74% và 74% cao hơn so với các chủng cịn lại. Do vậy, ch ng tơi lựa chọn 7 chủng vi khuẩn oxi hóa amoni này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Khả năng tạo màng vi sinh v t
Với mục tiêu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn khơng những có hoạt tính nitrate hóa mà cịn có khả năng tạo màng nên 7 chủng vi khuẩn BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI-9 và BNI-10 đƣ c nghiên cứu tiếp khả năng tạo màng biofilm. Khả năng tích lũy sinh khối và khả năng tạo màng biofilm của các chủng phân lập đƣ c trình bày tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni
Chủng phân lập Khả năng tạo màng OD 570nm Khả năng sinh trƣởng OD 600nm Đối chứng 0,210,01 0,2330,02 BNI-3 1,1280,132 0,8920,04 BNI-4 1,2680,123 0,7820,062 BNI-5 1,3430,11 0,8580,064 BNI-6 1,3170,123 0,2130,321 BNI-7 1,5430,156 0,5750,043 BNI-9 1,1780,123 0,9530,076 BNI-10 1,2220,12 0,7210,032
Kết quả cho thấy cả 7 chủng vi khuẩn lựa chọn đều có khả năng tạo màng biofilm ở các mức độ khác nhau. Lƣ ng sinh khối của các chủng BNI-3, BNI-4, BNI-5 và BNI-9 là cao hơn cả, nhƣng các chủng BNI-5, BNI-6, BNI-7 và BNI-10 lại có khả năng tạo màng cao hơn các chủng còn lại. Khả năng tạo màng đƣ c đánh giá bằng khả năng bắt màu với tím kết tinh đƣ c thể hiện ở hình 3.1. Kết quả cho thấy khả năng bắt màu của chủng BNI-5, BNI-10, BNI-6 và chủng BNI-7 là đậm hơn so với các chủng còn lại.
ĐC BNI-3 BNI-4 BNI-5 BNI-6 BNI-7 BNI-9 BNI-10
Hình 3.1. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni
Với mục tiêu chọn các chủng tạo màng sinh học mạnh nên chúng tôi lựa chọn chủng BNI-9 và BNI-8 cho các nghiên cứu tiếp theo về phân loại cũng nhƣ xác định hình thái hai chủng vi khuẩn này.
3.2.Vi khuẩn oxi hóa nitrite
3.2.1. h n l p tu n chọn vi hu n oxi h a nitrite
Tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni, các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrite đƣ c phân lập trên môi trƣờng Winogradsky 2 từ các mẫu nƣớc thải thu thập tại Bắc Ninh. Kết quả ch ng tôi đã phân lập và tách đƣ c 10 chủng vi khuẩn có khả năng oxi hóa nitrite lần lƣ t ký hiệu BNII-1, BNII-2, BNII- 3, BNII-4, BNII-5, BNII-6, BNII-7, BNII-8, BNII-9 và BNII-10.
Các chủng vi khuẩn phân lập đƣ cxác định khả năng sinh trƣởng và hoạt tính oxi hóa nitrite (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Khả năng oxi hóa nitrite của nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite
Chủng phân lập N-NO2 ban đầu (mg/l) N-NO2 còn lại (mg/l) N-NO3 tạo ra (mg/l) BNII-1 5 2,770,28 2,010,15 BNII-2 5 2,920,21 1,690,21 BNII-3 5 2,720,26 1,170,02 BNII-4 5 2,380,32 1,250,12 BNII-5 5 3,790,31 0,870,03 BNII-6 5 4,180,41 0,210,02 BNII-7 5 3,140,32 0,760,08 BNII-8 5 1,990,21 2,510,22 BNII-9 5 2,200,21 2,520,23 BNII-10 5 2,400,23 2,320,21
Trong cùng điều kiện nuôi cấy nhƣ nhau, trong số 10 chủng vi khuẩn đƣ c phân lập có 7 chủng BNII-1, BNII-2, BNII-3, BNII-4, BNII-8, BNII-9 và BNII-10 có khả năng oxi hóa nitrite cao hơn các chủng cịn lại. Trong đó, chủng BNII-8 có hoạt tính cao nhất và đạt hiệu suất loại nitrite gần 60%. Các chủng BNII-8 và BNII- 10 có hiệu suất loại nitrite gần tƣơng đƣ ng nhau vào đều trên 50%.
3.2.2. Khả năng tạo màng vi sinh v t
Các chủng phân lập, tuyển chọn đƣ c gồm BNII-1, BNII-2, BNII-3, BNII-4, BNII-8, BNII-9 và BNII-10 đƣ c tiếp tục nghiên cứu khả năng tích lũy sinh khối và khả năng tạo màng biofilm.
Kết quả bảng 3.4 cho thấy cả các chủng vi khuẩn lựa chọn đều có khả năng tạo màng sinh học thể hiện qua chỉ số OD 570nm. Khả năng tạo màng của các chủng khá tƣơng đƣơng nhau, chỉ có chủng BNII-8 và BNII-9 thấp hơn không đáng