cịn có khả năng tạo màng biofilm: BNI-8, BNI-9 (vi khuẩn oxi hóa amoni);BNII-9 và BNII-10 (vi khuẩn oxi hóa nitrite) cho các nghiên cứu phân tích tối ƣu điều kiện phát triển, phân huỷ nitơ cũng nhƣ phân loại.
3.3. Vi khuẩn phản nitrat hóa
3.3.1. Phân l p vi khu n phản nitrat hóa
Chúng tơi tiến hành phân lập trên mơi trƣờng phản nitrat hóa trong điều kiện kị khí. Kết quả phân lập đƣ c 32 chủng vi khuẩn (kí hiệu D1 đến D32), các chủng vi khuẩn này đƣ c tách biệt thành các loài riêng dựa vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc khuẩn lạc khi ni cấy trên mơi trƣờng có thạch (kết quả khơng trình bày ở đây).
3.3.2. Xác định khả năng phản nitrat hóa của các chủng phân l p được
Khả năng phản nitrat hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣ c cho thấysau 3-4 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trƣờng đặc trƣng của vi khuẩn khử nitrat chứa NaNO3 (5 g/l) ở điều kiện thiếu khí, nhiệt độ 22-25oC các phao khí bị đẩy nổi lên trên, cịn ở chứng (khơng chứa vi khuẩn) khơng phát hiện đƣ c hiện tƣ ng này. Khả năng sinh khí nhiều hay ít phụ thuộc vào phao khí đƣ c đẩy lên cao hay thấp. Trong số 32 chủng phân lập đƣ c, lựa chọn đƣ c 9 chủng (bảng 3.5).
Bảng 3.5. Khả năng sinh khí của các chủng phân lập
Ký hiệu chủng Khả năng sinh khí
D2 ++ D4 + D10 +++ D14 + D18 ++ D21 + D27 + D28 + D32 +++
3.3.3. Xác định hoạt tính khử nitrat của các chủng tuy n chọn
Để phát hiện chính xác khả năng phản nitrat hóa của những chủng vi khuẩn tuyển chọn, ngồi việc phát hiện khí trong ống phao còn tiến hành xác định hoạt tính khử nitrat dựa vào sự giảm nitrat hoặc xuất hiện nitrit trong môi trƣờng nuôi cấy dịch thể. Bốn chủng vi khuẩn D2, D10, D18 và D32 có khả năng sinh khí nhiều hơn các chủng còn lại đƣ c ni cấy kị khí trong mơi trƣờng chứa 20 mg N-NO3 trong 32 giờ. Hàm lƣ ng nitrat và nitrit trong môi trƣờng đƣ c trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Biến động hàm lƣ ng N-NO3 và N-NO2 trong môi trƣờng nuôi vi khuẩn Thời
gian
Kí hiệu
0 h sau 16 giờ sau 32 giờ N-NO3 (mg/l) N-NO2 mg/l N-NO3 mg/l N-NO2 mg/l N-NO3 mg/l N-NO2 mg/l D2 22,4 0 0,02 2,93 0,01 0,57 D10 22,9 0 0,04 3,13 0,03 0,27 D18 23,0 0 0,03 4,13 0,05 0,62 D32 22,5 0 0,02 2,87 0,02 0
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣ ng nitrat hầu nhƣ khơng cịn trong mơi trƣờng nuôi cấy chỉ sau 16 giờ, bên cạnh đó còn phát hiện thấy nitrit trong môi trƣờng nuôi cấy và lƣ ng nitrit này giảm đi ở giờ thứ 32, chứng tỏ trong q trình phản nitrat hóa đã xuất hiện các phản ứng khử nitrat.
Với mục tiêu lựa chọn những chủng vi khuẩn khơng những có khả năng khử nitrate mà cịn có khả năng tạo màng sinh học, nên 4 chủng vi khuẩn phản nitrate D2, D10, D18 và D32 đƣ c nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học. Các chỉ số OD620 (khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn) và OD570 (khả năng tạo màng sinh học) đƣ c trình bày trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng nghiên cứu
Kí hiệu chủng
Khả năng sinh trƣởng (OD620nm)
Khả năng tạo biofilm (OD570nm) D2 0,076 0,006 0,754 0,076 D10 0,328 0,023 1,765 0,166 D18 0,321 0,025 1,432 0,134 D32 0,478 0,042 1,632 0,164
Kết quả trong 4 chủng nghiên cứu có hai chủng D10 và D32 vừa có khả năng sinh trƣởng tốt lại tạo màng biofilm cao. Kết quả này đƣ c khẳng định qua khả năng bắt màu với tím kết tinh của 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu (hình 3.3).
ĐC D2 D32 D18 D10
H nh 3.3. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn khử nitrate
Qua quan sát khả năng bắt màu với tím kết tinh của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, chủng D2 có khả năng bắt màu kém nhất, hình ảnh đậm nhất là chủng D10 và D32 thể hiện khả năng tạo màng sinh học mạnh của hai chủng này.
Tuy nhiên do thời gian và điều kiện nghiên cứu cịn khó khăn nên các chủng vi khuẩn khử nitrat không đƣ c ch ng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu sâu hơn.
3.4. Nghiên cứu khả năng sinh trƣởng, tạo biofilm và hoạt tính chuyển hố ni tơ của các chủng tuyển chọn khi kết hợp với vật liệu mang.
3.4.1. Hoạt tính oxi hóa amoni của vi khu n khi có v t liệu mang
Để tăng khả năng tạo màng của vi khuẩn nitrate hóa việc sử dụng vật liệu mang (polyurethane) đƣ c cung cấp từ Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam gi p cho vi khuẩn bám dính và hình thành màng sinh học. Các
vật liệu mang này đã đƣ c đề cập trong các nghiên cứu [17, 26].
Nghiên cứu tiếp theo là đánh giá hoạt tính chuyển hóa amoni của các chủng BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI-8 và BNI-9 trong môi trƣờng bổ sung vật liệu mang polyurethane (kết quả đƣ c trình bày ở bảng 3.8).
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của chất mang đến khả năng oxi hóa amoni của vi khuẩn
Chủng phân lập
N-NH4+ ban đầu
(mg/l)
Không chất mang Bổ sung chất mang N-NH4+ còn lại (mg/l)* N- NO2- tạo ra (mg/l)* N-NH4+còn lại (mg/l)* N- NO2- tạo ra (mg/l)* BNI-3 5 0,822 3,416 0,571 3,642 BNI-4 5 0,776 3,522 0,554 3,914 BNI-5 5 0,835 2,910 0,637 3,710 BNI-6 5 0,731 3,548 0,486 4,301 BNI-7 5 0,714 3,482 0,569 3,813 BNI-8 5 0,698 3,420 0,445 4,301 BNI-9 5 0,731 3,355 0,478 4,052
Chú thích:* là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm
Các vi khuẩn nghiên cứu đƣ c nuôi lắc với hàm lƣ ng amoni ban đầu là 5mg N-NH4+ /l, vật liệu mang (polyurethane) chiếm 20% thể tích mơi trƣờng, pH = 7,8,
nhiệt độ 28 ± 2oC, thời gian nuôi cấy 6 ngày. Kết quả cho thấy, khi có vật liệu mang tất cả vi khuẩn đều có hoạt tính oxi hóa amoni cao hơn khi khơng có vật liệu mang. Hoạt tính chuyển hóa của các chủng BNI-6, BNI-7, BNI-9 và BNI-10 cao hơn 3 chủng còn lại (bảng 3.8).
Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng có khả năng tạo màng khi có chất mang thì sẽ kết dính lên bề mặt của giá thể, tăng hoạt tính chuyển hóa amoni.
3.4.2. Hoạt tính oxi hóa nitrite của vi khu n khi có v t liệu mang
nuôi bổ sung vật liệu mang polyurethan xốp.
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở bảng 3.6, cho thấy trong 7 chủng nghiên cứu các chủng BNII-4, BNII-8, BNII-9 và BNII-10 có khả năng chuyển hóa nitrite cao hơn 3 chủng cịn lại trong đó các chủng BNII-9 và BNII-10 có hoạt tính mạnh nhất khi bổ sung vật liệu mang. Hình 3.4 là hình ảnh hiển vi chụp chủng BNII-10 có mặt trong vật liệu mang. Kết quả ở hình 3.4 cho thấy chủng BNII-10 đã sinh trƣởng mạnh và tạo màng liên kết với nhau và vật liệu mang.
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của chất mang tới khả năng oxi hóa nitrite của các chủng
Chủng phân lập
N-NO2 ban đầu (mg/l)
Không bổ sung vật liệu mang Bổ sung vật liệu mang N-NO2 còn lại (mg/l)* N-NO3 tạo ra (mg/l)* N-NO2 còn lại (mg/l)* N-NO3 tạo ra (mg/l)* BNII-1 5 0,92 3,91 0,83 4,01 BNII-2 5 1,22 3,54 1,06 3,24 BNII- 3 5 1,31 3,36 1,22 3,51 BNII-4 5 0,94 3,78 0,92 3,95 BNII-8 5 0,92 4,12 0,77 4,42 BNII-9 5 0,77 4,32 0,55 4,44 BNII-10 5 0,89 4,17 0,68 4,26
Chú thích: * là kết quả của 3 lần thí nghiệm.
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khi nhiệt độ thay đổi, hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên cứu cũng ảnh hƣởng theo, nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ từ 10oC đến 37oC đã đƣ c tiến hành (hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn
A. Chủng BNI-8; B. Chủng BNII-9
Kết quả hình 3.5 cho thấy hai chủng đại diện BNI-8 và BNII-9 đều có hoạt tính ở khoảng nhiệt độ từ 20 đến 30oC. Tại nhiệt độ này lƣ ng amoni giảm 62,2% (hình 3.5A), cịn nitrite giảm đƣ c 59% (hình 3.5B). Ở nhiệt độ 10oC hay 37oC, hoạt tính nitrate hóa của cả hai chủng vi khuẩn giảm.
A 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) CN (m g /l )
N-NH4 còn lại mg/l N-NO2 tạo thành (mg/l)
B 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) CN ( m g /l )
Ngồi việc tìm hiểu hoạt tính nitrate hóa của các chủng nghiên cứu ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng tạo màng và sinh trƣởng của các chủng phân lập cũng đƣ c nghiên cứu (hình 3.6).
ĐC 10oC 20oC 30oC 37oC
Hình 3.6. Khả năng tạo màng vi sinh vật của chủng BNI-8
ĐC 10oC 20oC 30oC 37oC
Hình 3.7. Khả năng tạo màng vi sinh vật của chủng BNII-9
Kết quả hình 3.6 và 3.7 cho thấy, màng biofilm hình thành trên thành ống eppendorf của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có màu đậm hơn trongkhoảng nhiệt độ 20-37oC. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ của đề tài cũng trùng h p với nghiên cứu trƣớc đây [20, 24] khi nghiên cứu về nhóm vi khuẩn nitrate hóa có mặt trong nƣớc ngọt.Nghiên cứu của các tác giả Việt Nam [32] cũng cho thấy các chủng tạo biofilm trong đất có hoạt tính chuyển hóa amoni thƣờng có khoảng nhiệt độ hoạt động thích h p từ 30 đến 37oC.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH môi trường
Một trong những điều kiện khác ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh trƣởng, hoạt tính chuyển hóa nitơ và khả năng tạo màng sinh vật của vi khuẩn là pH môi trƣờng. Hai chủng BNI-8 và BNII-9 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và khả năng tạo biofilm. Kết quả có trong hình từ hình 3.8 đến hình 3.11.
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH tới chủng BNI-8 (màu tím) và BNII-9 (màu hồng)
Tại giá trị pH 7,5 và 8 của mơi trƣờng cả hai chủng vi khuẩn đều có khả năng oxi hóa amoni (chủng BNI-8) hay oxi hóa nitrite (chủng BNII-9) cao nhất (hình 3.6). Tại các giá trị pH này amoni bị loại khoảng 65% (chủng BNI-8), còn nitrite bị loại khoảng 72% (chủng BNII-9). Trong môi trƣờng axit (pH 5 và pH6) hoặc môi trƣờng kiềm (pH 9 và pH 10) hoạt tính nitrate hóa của các vi khuẩn này thấp hơn.
Tại giá trị pH môi trƣờng là 7,5 và 8 khả năng tạo màng sinh vật cũng nhƣ sinh trƣởng của vi khuẩn nghiên cứu đạt mức cao nhất. Ở pH 9 sinh trƣởng và tạo biofilm của vi khuẩn bắt đầu giảm (hình 3.9).
A 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 6 7 8 9 10 11 pH CN ( m g /l )
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tạo màng và sinh trƣởng
A. Chủng BNI-8 B. Chủng BNII-9
ĐC pH 5 pH 6 pH 7 pH 7,5 pH 8 pH 9 pH 10
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tạo màng biofilm của chủng BNI-8 A 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 pH 5 pH 6 pH 7 pH 7.5 pH8 pH 9 pH 10 pH OD OD 570 OD 600 B 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 pH 5 pH 6 pH 7 pH 7.5 pH8 pH 9 pH 10 pH OD OD 570 OD 600
ĐC pH 5 pH 6 pH 7 pH 7,5 pH 8 pH 9 pH 10
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tạo màng biofilm của chủng BNII-9
Tại pH kiềm 7,5 và 8 vi khuẩn nitrate hóa thích nghi hơn nên có hoạt tính chuyển hóa nitơ tốt hơn đồng thời ch ng sinh trƣởng và có khả năng tạo biofilm tốt hơn ở những điểm pH khác. Các chỉ số OD570và OD600 và hình ảnh mảng bám trên thành ống eppendorf có màu đậm khẳng định kết quả thu đƣ c (hình 3.9).
Các cơng bố trƣớc đây [44, 49] cho rằng ở pH thấp hơn 6,5 và trên 8,9 thì q trình nitrate hóa bị ức chế. Theo nghiên cứu của Nadell và cộng sự enzym ammonia monooxigenase bị bất hoạt và ngừng chuyển hóa amoni ở pH6 [43]. Nghiên cứu [7,10] cho thấy vi khuẩn nitrate hóa sinh trƣởng bình thƣờng ở pH 7-8, tốc độ sinh trƣởng tối đa của cả 2 nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni và oxi hóa nitrite là ở pH 8.
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ amoni và nitrit đến sinh trưởng của các chủng vi hu n nitrate h a tu n chọn
Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy, các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều sinh trƣởng và tạo màng sinh học tốt ở nồng độ nitơ từ 10-100 mgN/l. Ở nồng độ amoni là 5 và 200 mgN/l, vi khuẩn oxi hóa amoni vẫn sinh trƣởng nhƣng chậm hơn. Ở nồng độ quá thấp (2 mgN/l), hoặc quá cao (500; 1000 mgN/l), sinh trƣởng cũng nhƣ khả năng tạo biofilm của vi khuẩn bị ức chế.Kết quả với các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrit cũng tƣơng tự (hình 3.12).
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của amoni hay nitrit đến sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn
A.Vi khuẩn oxi hóa amoni (BNI-9); B. Vi khuẩn oxi hóa nitrit (BNII-10) Khi nghiên cứu về ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni trong đất các nhà nghiên cứu nhận thấy ở nồng độ amoni từ 20 - 100mg/l ( 1,5 - 7,5 mM) các tế bào của vi khuẩn oxi hóa amoni sau
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 2 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l 100 mg/l 200 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l OD 570 OD 600 A 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 2 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l 100 mg/l 200 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l OD 570 OD 600 B
môi trƣờng cũng ảnh hƣởng rất mạnh đến khả năng chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu [12, 13]. Ở nồng độ nitơ cao từ 500 - 1000 mgN/l, hoạt tính nitrat hóa của vi khuẩn oxi hóa amoni gần nhƣ bằng khơng. Nghiên cứu cho thấy, hoạt tính oxi hóa amoni của Nitrosomnas europaea bị bất hoạt khi lƣ ng nitrit tạo thành trong môi trƣờng nuôi cấy đạt từ 20 mM (267 mgN/l) trở lên. Hoạt tính oxi hóa nitrit của các chủng vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter sẽ bị ức chế khi hàm lƣ ng nitrat hình thành trong mơi trƣờng đạt 30 - 60mM (khoảng 400-800 mgN/l).
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, nồng độ amoni hay nitrit quá thấp ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của vi khuẩn, nếu trong môi trƣờng chứa amoni với nồng độ quá cao (>200 mg/l) sinh trƣởng của vi khuẩn thấp, rất có thể lƣ ng nitrit tạo thành sẽ ức chế amonia monooxigenase x c tác phản ứng oxi hóa amoni.Sự kết h p hai nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni và oxi hóa nitrit trong tự nhiên là l i thế, tránh sự tích lũy nitrit trong môi trƣờng tạo nên yếu tố gây độc [25, 36, 42].
3.5. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của các chủng phân l p
Trình tự gen 16S rRNA của 4 chủng BNI-8, BNI-9, BNII-9 và BNII-10 đã đƣ c xử lý bằng phần mềm DNA Star và BLAST, sau đó so sánh với các trình tự gen mã hóa 16S rRNA của các chủng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn trên Ngân hàng Gen quốc tế. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu BNI-8, BNI-9, BNII-9 và BNII-10 trên hình 3.13.
Kết quả hình 3.13 cho thấy hai chủng BNI-8 và BNI-9 đều nằm trên nhánh thuộc chi Nitrosomonas và thuộc β-Proteobacteria. So với trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng Nitrosomonas eutropha trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng BNI-8có độ tƣơng đồng 96%; trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng BNI-9 so với lồi Nitrosomonas europaea cũng có độ tƣơng đồng 96%.
Hai chủng BNII-9 và BNII-10 nằm hoàn toàn trên nhánh của vi khuẩn oxi hóa nitrit đều thuộc chi Nitrobacter và thuộc Gamma Proteobacteria. Trình tự gen
16S rRNA của chủng BNII-9 và BNII-10 so với trình tự gen 16S rRNA của loài
Nitrobacter winogradski có độ tƣơng đồng là 97% và 96%, tƣơng ứng, so với trình