CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.6. Phƣơng pháp phân tích nitơ tổng số
Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển tồn bộ nitơ ở cả dạng vô cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở bƣớc sóng 220 nm [9].
Phƣơng pháp làm nhƣ sau: Xử lý mẫu
Thêm 10 ml dd A (dd A : 4 g NaOH + 3 g K2S2O8)/100ml nƣớc cất. N t chặt và đun trong nồi khử trùng ở 120°C trong 30 ph t.
Sau đó lấy 30 ml mẫu vào bình định mức 50 ml, lọc loại bỏ vẩn đục. Thêm 6,5 ml HCl (HCl:H2O = 1:15 về thể tích).
Lắc và định mức tới 50 ml bằng nƣớc khử ion. Lập đƣờng chuẩn
Chuẩn bị đƣờng chuẩn gồm 4 điểm bằng bình định mức 50ml
Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,722 g KNO3 bằng nƣớc cất, sau đó định mức lên 1000 ml, đựng trong chai màu nâu, bảo quản trong tủ lạnh.
Dung dịch chuẩn 10 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc ra 10 lần Cách tiến hành: lấy thể tích dung dịch chuẩn theo tỷ lệ vào 4 bình định mức, thêm vào mỗi bình 0,5 ml dung dịch HCl, định mức tới 50 ml bằng nƣớc cất, lắc đều. Sau đó đo ở bƣớc sóng 220 nm.
Với mẫu sau khi thực hiện bƣớc xử lý mẫu xong cũng tiến hành tƣơng tự nhƣ bƣớc lập đƣờng chuẩn
Tính tốn kết quả
mgN- T = mgN-
Ch ý: giới hạn của phép đo là < 3 mg/l, nếu hàm lƣ ng nitơ trong mẫu nằm quá giới hạn thì phải pha lỗng mẫu.
2.3.7. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng amoni (NH4+
)
Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn đƣ c phân tích dựa trên nồng độ amoni trong môi trƣờng theo các khoảng thời gian nuôi.
Nguyên tắc:
Phản ứng của NH4+và hypochloride với sự có mặt của x c tác phenol tạo thành h p chất indophenol blue. So màu ở bƣớc sóng 640 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Hypochloride: 15g NaOH khan + 500 ml NaClO 0,1% sau đó định mức đến 1000ml bằng nƣớc khử ion.
nitroprusside (Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O), định mức đến 500 ml bằng nƣớckhử ion.Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn đƣ c lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105°C trong 3 giờ, để nguội trong bình h t ẩm. Cân 3,819g NH4Cl, hòa tan và định mức đến 1000 ml bằng nƣớc khử ion. Dung dịch có nồng độ N- NH4+ là 1 g/l. Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc.
Lập đƣờng chuẩn: tƣơng ứng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l. Lấy 5 ml mẫu vào ống thủy tinh.
Thêm 3 ml thuốc thử phenol- sodium nitroprusside. Lắc trên máy rung 30 giây.
Thêm 3 ml hypochloride. Lắc trên máy rung 30 giây. Điều nhiệt ở 37°C trong 25 ph t. Đo ở bƣớc sóng 640 nm.
Với mẫu cũng làm các bƣớc tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chuẩn.
2.3.8. Phƣơng pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite
Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3-) của các chủng đƣ c đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trƣờng nuôi cấy.
Nguyên tắc:
Phản ứng giữa nitrite và hỗn h p sulfanylamide với naphtylendiamine tạo phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bƣớc sóng 540 nm [9].
Chuẩn bị thuốc thử:
Dung dịch sunfanylamide: cân 0,6 g sunfanylamide hịa tan trong 50 ml nƣớc cất nóng, làm lạnh, thêm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.
Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0,1g naphtylendiamine dihydrochloride hòa tan trong 100 ml nƣớc cất, đựng trong chai màu nâu, bảo quản lâu dài ở 4o
C. Lập đƣờng chuẩn:
Hòa tan 1,23g NaNO2 trong 1000 ml nƣớc cất. Dung dịch gốc có nồng độN- NO2 là 250 mg/l.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/l bằng cách pha dung dịchgốc. Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.
Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau. Thêm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.
Trộn đều và giữ yên trong 5 ph t. Thêm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl. Trộn đều và giữ yên trong 10 ph t. So màu ở bƣớc sóng 540 nm.
Với các dung dịch mẫu làm tƣơng tự nhƣ lập đƣờng chuẩn.
2.3.9. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA
Các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý nitơ đƣ c phân tích trình tự gen 16S rRNA để xác định cây phân loại.
Trình tự gen đoạn 16S rRNA đƣ c đọc trên máy đọc trình tự tự động ABIPRISM 3100 Avant (Mỹ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN
Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA đƣ c so sánh với trình tự đoạn gentƣơng tƣng của các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phƣơng pháp Clustal X. Cây phát sinh chủng loại đƣ c xây dựng dựa trên phần mềm njplot.
2.3.10. Phƣơng pháp thống kê sinh học
Các kết quả thu đƣ c đƣ c xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phầnmềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Vi khuẩn oxi hóa amoni 3.1. Vi khuẩn oxi hóa amoni
3.1.1. h n l p tu n chọn vi hu n oxi h a amoni
Từ các mẫu thải bị ô nhiễm amoni thu thập đƣ c, tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn sinh trƣởng đƣ c trên các môi trƣờng đặc trƣng- môi trƣờng Winogradsky 1. Các chủng vi khuẩn lựa chọn đƣ c xác định khả năng oxi hóa amoni thành nitrite.
Kết quả đã phân lập và tuyển chọn đƣ c 10 chủng vi khuẩn oxi hóa amoni đƣ c ký hiệu lần lƣ t là: BNI-1, BNI-2, BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI- 8, BNI-9, BNI-10.
Khả năng sinh trƣởng và hoạt tính của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni sau 5 ngày nuôi cấy lắc đƣ c thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng oxi hóa amoni của nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni
Chủng phân lập N-NH4 ban đầu (mg/l) N-NH4 còn lại (mg/l) N-NO2 tạo ra (mg/l) BNI-1 5 3,580,4 1,40,11 BNI-2 5 3,600,36 1,40,12 BNI-3 5 1,430,15 3,2 0,33 BNI-4 5 1,430,16 3,50,4 BNI-5 5 1,890,17 2,90,31 BNI-6 5 1,080,09 3,60,41 BNI-7 5 1,24 0,12 3,70,36 BNI-8 5 2,680,26 2,10,22 BNI-9 5 1,100,09 3,70,38 BNI-10 5 1,560,16 3,30,34
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, các chủng BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI-9 và BNI-10 có khả năng oxi hóa amoni cao hơn các chủng khác. Đặc biệt,
hiệu suất loại amoni của các chủng BNI-6, BNI-7 và BNI-9 đạt tƣơng ứng là 72%, 74% và 74% cao hơn so với các chủng cịn lại. Do vậy, ch ng tơi lựa chọn 7 chủng vi khuẩn oxi hóa amoni này cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Khả năng tạo màng vi sinh v t
Với mục tiêu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn khơng những có hoạt tính nitrate hóa mà cịn có khả năng tạo màng nên 7 chủng vi khuẩn BNI-3, BNI-4, BNI-5, BNI-6, BNI-7, BNI-9 và BNI-10 đƣ c nghiên cứu tiếp khả năng tạo màng biofilm. Khả năng tích lũy sinh khối và khả năng tạo màng biofilm của các chủng phân lập đƣ c trình bày tại bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni
Chủng phân lập Khả năng tạo màng OD 570nm Khả năng sinh trƣởng OD 600nm Đối chứng 0,210,01 0,2330,02 BNI-3 1,1280,132 0,8920,04 BNI-4 1,2680,123 0,7820,062 BNI-5 1,3430,11 0,8580,064 BNI-6 1,3170,123 0,2130,321 BNI-7 1,5430,156 0,5750,043 BNI-9 1,1780,123 0,9530,076 BNI-10 1,2220,12 0,7210,032
Kết quả cho thấy cả 7 chủng vi khuẩn lựa chọn đều có khả năng tạo màng biofilm ở các mức độ khác nhau. Lƣ ng sinh khối của các chủng BNI-3, BNI-4, BNI-5 và BNI-9 là cao hơn cả, nhƣng các chủng BNI-5, BNI-6, BNI-7 và BNI-10 lại có khả năng tạo màng cao hơn các chủng còn lại. Khả năng tạo màng đƣ c đánh giá bằng khả năng bắt màu với tím kết tinh đƣ c thể hiện ở hình 3.1. Kết quả cho thấy khả năng bắt màu của chủng BNI-5, BNI-10, BNI-6 và chủng BNI-7 là đậm hơn so với các chủng còn lại.
ĐC BNI-3 BNI-4 BNI-5 BNI-6 BNI-7 BNI-9 BNI-10
Hình 3.1. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni
Với mục tiêu chọn các chủng tạo màng sinh học mạnh nên chúng tôi lựa chọn chủng BNI-9 và BNI-8 cho các nghiên cứu tiếp theo về phân loại cũng nhƣ xác định hình thái hai chủng vi khuẩn này.
3.2.Vi khuẩn oxi hóa nitrite
3.2.1. h n l p tu n chọn vi hu n oxi h a nitrite
Tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp phân lập các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni, các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrite đƣ c phân lập trên môi trƣờng Winogradsky 2 từ các mẫu nƣớc thải thu thập tại Bắc Ninh. Kết quả ch ng tôi đã phân lập và tách đƣ c 10 chủng vi khuẩn có khả năng oxi hóa nitrite lần lƣ t ký hiệu BNII-1, BNII-2, BNII- 3, BNII-4, BNII-5, BNII-6, BNII-7, BNII-8, BNII-9 và BNII-10.
Các chủng vi khuẩn phân lập đƣ cxác định khả năng sinh trƣởng và hoạt tính oxi hóa nitrite (bảng 3.3).
Bảng 3.3. Khả năng oxi hóa nitrite của nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite
Chủng phân lập N-NO2 ban đầu (mg/l) N-NO2 còn lại (mg/l) N-NO3 tạo ra (mg/l) BNII-1 5 2,770,28 2,010,15 BNII-2 5 2,920,21 1,690,21 BNII-3 5 2,720,26 1,170,02 BNII-4 5 2,380,32 1,250,12 BNII-5 5 3,790,31 0,870,03 BNII-6 5 4,180,41 0,210,02 BNII-7 5 3,140,32 0,760,08 BNII-8 5 1,990,21 2,510,22 BNII-9 5 2,200,21 2,520,23 BNII-10 5 2,400,23 2,320,21
Trong cùng điều kiện nuôi cấy nhƣ nhau, trong số 10 chủng vi khuẩn đƣ c phân lập có 7 chủng BNII-1, BNII-2, BNII-3, BNII-4, BNII-8, BNII-9 và BNII-10 có khả năng oxi hóa nitrite cao hơn các chủng cịn lại. Trong đó, chủng BNII-8 có hoạt tính cao nhất và đạt hiệu suất loại nitrite gần 60%. Các chủng BNII-8 và BNII- 10 có hiệu suất loại nitrite gần tƣơng đƣ ng nhau vào đều trên 50%.
3.2.2. Khả năng tạo màng vi sinh v t
Các chủng phân lập, tuyển chọn đƣ c gồm BNII-1, BNII-2, BNII-3, BNII-4, BNII-8, BNII-9 và BNII-10 đƣ c tiếp tục nghiên cứu khả năng tích lũy sinh khối và khả năng tạo màng biofilm.
Kết quả bảng 3.4 cho thấy cả các chủng vi khuẩn lựa chọn đều có khả năng tạo màng sinh học thể hiện qua chỉ số OD 570nm. Khả năng tạo màng của các chủng khá tƣơng đƣơng nhau, chỉ có chủng BNII-8 và BNII-9 thấp hơn không đáng kể so với các chủng khác, nhƣng khả năng tích lũy sinh khối trong quá trình sinh trƣởng của ch ng lại cao hơn.
Kết quả hình 3.2 cho thấy các chủng BNII-1, BNII-2, BNII-3 và BNII-4 có màu đậm hơn so với màu tạo bởi chủng BNII-8, BNII-9 và BNII-10 thể hiện khả năng tạo biofilm tốt hơn so với các chủng còn lại. Tuy vậy chủng BNII-8 qua quan sát có khả năng phát triển tƣơng đối chậm và do điều kiện thời gian nên ch ng tôi lựa chọn hai chủng BNII-9 và BNII-10 cho nghiên cứu phân loại.
Bảng 3.4. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Chủng phân lập Khả năng tạo màng OD 570nm Khả năng sinh trƣởng OD 600nm BNII-1 1,7800,17 0,3360,032 BNII-2 1,7850,176 0,4460,031 BNII-3 1,7660,181 0,3060,033 BNII-4 1,7670,125 0,3010,121 BNII-8 1,6680,167 0,4910,421 BNII-9 1,6200,165 0,6010,545 BNII-10 1,7500,165 0,5810,571
Kết quả cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đều tạo màng sinh học tốt. Dựa vào khả năng chuyển hóa nitrite thành nitrate, khả năng sinh trƣởng phát triển, ch ng tôi lựa chọn 02 chủng BNII-9 vàBNII-10 cho các nghiên cứu xác định vị trí phân loại của hai chủng này.
ĐC BNII-1 BNII-2 BNII-3 BNII-4 BNII-8 BNII-9 BNII-10
Hình 3.2. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrite
cịn có khả năng tạo màng biofilm: BNI-8, BNI-9 (vi khuẩn oxi hóa amoni);BNII-9 và BNII-10 (vi khuẩn oxi hóa nitrite) cho các nghiên cứu phân tích tối ƣu điều kiện phát triển, phân huỷ nitơ cũng nhƣ phân loại.
3.3. Vi khuẩn phản nitrat hóa
3.3.1. Phân l p vi khu n phản nitrat hóa
Chúng tôi tiến hành phân lập trên môi trƣờng phản nitrat hóa trong điều kiện kị khí. Kết quả phân lập đƣ c 32 chủng vi khuẩn (kí hiệu D1 đến D32), các chủng vi khuẩn này đƣ c tách biệt thành các lồi riêng dựa vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc khuẩn lạc khi ni cấy trên mơi trƣờng có thạch (kết quả khơng trình bày ở đây).
3.3.2. Xác định khả năng phản nitrat hóa của các chủng phân l p được
Khả năng phản nitrat hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣ c cho thấysau 3-4 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trƣờng đặc trƣng của vi khuẩn khử nitrat chứa NaNO3 (5 g/l) ở điều kiện thiếu khí, nhiệt độ 22-25oC các phao khí bị đẩy nổi lên trên, cịn ở chứng (khơng chứa vi khuẩn) khơng phát hiện đƣ c hiện tƣ ng này. Khả năng sinh khí nhiều hay ít phụ thuộc vào phao khí đƣ c đẩy lên cao hay thấp. Trong số 32 chủng phân lập đƣ c, lựa chọn đƣ c 9 chủng (bảng 3.5).
Bảng 3.5. Khả năng sinh khí của các chủng phân lập
Ký hiệu chủng Khả năng sinh khí
D2 ++ D4 + D10 +++ D14 + D18 ++ D21 + D27 + D28 + D32 +++
3.3.3. Xác định hoạt tính khử nitrat của các chủng tuy n chọn
Để phát hiện chính xác khả năng phản nitrat hóa của những chủng vi khuẩn tuyển chọn, ngồi việc phát hiện khí trong ống phao cịn tiến hành xác định hoạt tính khử nitrat dựa vào sự giảm nitrat hoặc xuất hiện nitrit trong môi trƣờng nuôi cấy dịch thể. Bốn chủng vi khuẩn D2, D10, D18 và D32 có khả năng sinh khí nhiều hơn các chủng cịn lại đƣ c ni cấy kị khí trong mơi trƣờng chứa 20 mg N-NO3 trong 32 giờ. Hàm lƣ ng nitrat và nitrit trong mơi trƣờng đƣ c trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Biến động hàm lƣ ng N-NO3 và N-NO2 trong môi trƣờng nuôi vi khuẩn Thời
gian
Kí hiệu
0 h sau 16 giờ sau 32 giờ N-NO3 (mg/l) N-NO2 mg/l N-NO3 mg/l N-NO2 mg/l N-NO3 mg/l N-NO2 mg/l D2 22,4 0 0,02 2,93 0,01 0,57 D10 22,9 0 0,04 3,13 0,03 0,27 D18 23,0 0 0,03 4,13 0,05 0,62 D32 22,5 0 0,02 2,87 0,02 0
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣ ng nitrat hầu nhƣ khơng cịn trong mơi trƣờng nuôi cấy chỉ sau 16 giờ, bên cạnh đó cịn phát hiện thấy nitrit trong môi trƣờng nuôi cấy và lƣ ng nitrit này giảm đi ở giờ thứ 32, chứng tỏ trong q trình phản nitrat hóa đã xuất hiện các phản ứng khử nitrat.
Với mục tiêu lựa chọn những chủng vi khuẩn khơng những có khả năng khử nitrate mà cịn có khả năng tạo màng sinh học, nên 4 chủng vi khuẩn phản nitrate D2, D10, D18 và D32 đƣ c nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học. Các chỉ số OD620 (khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn) và OD570 (khả năng tạo màng sinh học) đƣ c trình bày trên bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng nghiên cứu
Kí hiệu chủng
Khả năng sinh trƣởng (OD620nm)
Khả năng tạo biofilm (OD570nm) D2 0,076 0,006 0,754 0,076 D10 0,328 0,023 1,765 0,166 D18 0,321 0,025 1,432 0,134 D32 0,478 0,042 1,632 0,164
Kết quả trong 4 chủng nghiên cứu có hai chủng D10 và D32 vừa có khả năng sinh trƣởng tốt lại tạo màng biofilm cao. Kết quả này đƣ c khẳng định qua khả năng bắt màu với tím kết tinh của 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu (hình 3.3).
ĐC D2 D32 D18 D10
H nh 3.3. Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn khử nitrate
Qua quan sát khả năng bắt màu với tím kết tinh của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, chủng D2 có khả năng bắt màu kém nhất, hình ảnh đậm nhất là chủng D10 và D32 thể hiện khả năng tạo màng sinh học mạnh của hai chủng này.
Tuy nhiên do thời gian và điều kiện nghiên cứu cịn khó khăn nên các chủng vi khuẩn khử nitrat không đƣ c ch ng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu sâu hơn.