2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng
Mẫu mơ đại trực tràng bình thƣờng và mơ ung thƣ đƣợc lấy ra từ tủ -80o
C, rã đông. Cân 2 mẫu mô với lƣợng tƣơng đƣơng (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên đá. Quy trình xử lý mẫu mơ đại trực tràng đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Bước 1. Thu các phân đoạn dịch chiết protein
Mẫu mô đƣợc cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ. Bổ sung 100 µl đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4. Chuyển tồn bộ mẫu mơ đã cắt và dịch
đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4oC. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 1 đƣợc bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở 4o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 2.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 2 đƣợc hịa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 3 đƣợc hịa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4o
C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 2.
Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 4 đƣợc hịa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4o
C trong 60 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 3.
Bước 2. Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hút loại lớp mỡ phía trên. Bƣớc loại mỡ đƣợc lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa.
Bước 3. Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được
Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc sau quá trình loại mỡ ở tốc độ 60.000g trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn. Bƣớc này đƣợc lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa.
Bước 4. Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch của mẫu
Dịch chiết protein thu đƣợc từ các phân đoạn sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của mẫu. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%, để ở -20oC trong ít nhất 2 tiếng đến qua đêm. Các protein lắng tủa đƣợc thu lại sau khi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút, ở 4o
C trong thời gian 10 phút sẽ đƣợc hòa tan lại bằng đệm lysis. Kết quả làm sạch mẫu dịch protein bằng phƣơng pháp tủa cũng đƣợc kiểm tra bằng cách điện di dung dịch sau khi hòa tủa trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Các dịch chiết của cùng một mẫu đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.