CHƢƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2 Detector khối phổ
2.2.2.1 Nguyên tắc
Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu đƣợc ion hóa trong pha khí hoặc pha ngƣng tụ dƣới chân khơng cao, tạo thành các ion có số khối khác nhau, các ion này đƣợc phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điện tích (m/z) [6, 8]. Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích nhƣ loại bỏ electron, proton hóa... Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó cho thơng tin về khối lƣợng hay cấu trúc phân tử của hợp chất.
Bơm chân khơng
Hình 2.1: Sơ đồ khối của khối phổ kế
Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion sau đó đƣa vào bộ
Ion hóa Phân tách khối
Thu nhận ion
Xử lý dữ liệu
phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu đƣợc sẽ chuyển vào máy tính xử lý và lƣu trữ.
Ƣu điểm của phƣơng pháp là:
Giúp phát hiện hầu hết các chất tan
Độ nhạy cao
Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.
Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.
Cung cấp đầy đủ thông tin về cấu trúc và khối lƣợng [4]
2.2.2.2 Bộ nguồn ion (Ion sources)
Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lƣợng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hố phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Sau đây là một số kỹ thuật thƣờng dùng:
a) Ion hóa bằng dịng electron (Electron Ionization – EI):
Trong phổ EI-MS, dịng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây catot vonfram hoặc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dịng electron chuyển động vng góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử hoặc ion mảnh. Thông thƣờng các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng 8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợc hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .
ABC + e → ABC+● + 2e (1) (ion phân tử)
ABC+● → A+ + BC● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)
ABC+● → A+ + B +C●
Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoặc khơng thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi.
b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)
Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào điện trƣờng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của bộ phân tích khối phổ. Các giọt tích điện trƣớc khi vào bộ phân tích khối phổ sẽ kết hợp với dịng khí khơ để làm bay hơi hết dung mơi.
Hình 2.2: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI
Ƣu điểm của ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dƣơng và ion âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng nhƣ phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, khơng bền nhiệt, phân cực và không phân cực.
c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI)
Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dƣơng hay âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí nhƣ methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+
)...
Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các q trình ion hóa nhƣ sau:
Q trình 1:
CH4 + e → CH4+● + CH3+ + CH2+ CH4+● + CH4 → CH5+ + CH3●
CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2
Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu.
CH5+ + M → CH4 + (MH)+ (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1) C2H5+ + M → (MH)+ + C2H4 (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)
C2H5+ + M → (MC2H5)+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29) C2H5+ + M → (M-H)+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1)
Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn lọc của sự ion hóa và mức độ phân mảnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao cho phép phân tích định lƣợng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng địi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.
2.2.2.3 Bộ phân tích khối phổ (analyser)
Bộ phân tích đƣợc coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. Một số bộ phân tích khối phổ thơng thƣờng
- Bộ phân tích tứ cực.
- Bộ phân tích thời gian bay.
a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)
Nguyên tắc: tạo ra một trƣờng tần số vơ tuyến biến đổi (trƣờng tứ cực).Bộ phân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập ba
Bộ phân tích tứ cực đơn (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực
bằng kim loại đặt song song và theo hƣớng của chùm ion. Trƣờng tĩnh điện đƣợc tạo ra do thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) đƣợc đặt vào các thanh. Các tứ cực nhƣ bộ lọc khối, khi có điện trƣờng thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động
phụ thuộc vào tỉ số m/z và từ trƣờng RF. Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này.
Bộ phân tích tứ cực MS/MS (Triplequad mass spectometry): Bộ phân tích
khối bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau. Ion sinh ra đƣợc tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đƣa vào bộ phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ lọc ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này đƣợc tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tƣơng tác với khí trơ và đƣợc phân tích bằng tứ cực thứ ba. Đây là kỹ thuật phân tích khối phổ hai lần (MS/MS).
Hình 2.3: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực MS/MS
Kỹ thuật MS một lần có nhƣợc điểm là khơng nghiên cứu đƣợc cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hƣởng rõ rệt của nền mẫu chất phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử. Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên mà cịn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lƣợng femtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hƣởng của nền mẫu. Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập đƣợc nối với nhau cách nhau buồng va chạm (Collision Cell).
b) Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight analyser – TOF)
Các ion ra khỏi buồng ion hoá đƣợc gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ống phân tích (khơng có trƣờng điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng. Tuy nhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector. Thời gian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với m z của các ion. Các ion sẽ
đƣợc phát hiện ở các thời điểm khác nhau. Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính với thang m/z.