TT Vùng gen nhân bản Trình tự mồi 5’-3’ Ký hiệu 1 rbcL ATGTCACCACAAACAGAAAC P2F TCGCATGTACCTGCAGTAGC P2R 2 psbA-trnH GTTATGCATGAACGTAATGCTC P10F CGCGCATGGTGGATTCACAATCC P10R 3 rpoB AAGTGCATTGTTGGAACTGG P5F GATCCCAGCATCACAATTCC P5R 4 ITS ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG P12F TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC P12R
5 PuC18 CAGGGTTTTCCCAGTCACGA puC18F
GCGGATAACAATTTCACACA puC18R
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các bước nghiên cứu
- Thu thập mẫu lá ở các cây dó bầu
- Tách chiết tinh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu dó bầu
- Sử dụng phƣơng pháp PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mồi đặc hiệu - Tách dịng đoạn gen quan tâm
- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây dó bầu
DNA đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bƣớc sau.
- Cân 200 mg mẫu lá cây dó bầu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất. Ly tâm 13000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút.
- Bổ sung 0,6 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), đảo nhẹ thành hỗn hợp đồng nhất. Ủ trong 1 giờ 30 phút ( thỉnh thoảng đảo đều ).
- Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 13000 v/p ở 4oC. Hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung 0,8 ml isopropanol, đảo nhẹ, để ở tủ -20oC trong 1 giờ (ít nhất 20 phút). Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi thu tủa.
- Bổ sung 0,8 ml cồn 70%. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa.
- Làm khô DNA ở nhiệt độ phịng.
- Hịa tan DNA trong 200 µl nƣớc khử ion. Bổ sung 0,5 µl RNase (100 mg/ml) ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Bảo quản DNA tổng số ở -20o
C