Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3 Buffer T4 ligase 1 pBT 1 T4 DNA ligase 1 DNA 5 Tổng thể tích 10
2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli
Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA đƣợc gọi là tế bào khả biến.
Quy trình.
- Tế bào khả biến lấy từ tủ -83 0C ra và cho vào đá khoảng 10 phút trƣớc khi biến nạp.
- Bổ sung 10 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 5 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vịng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 200 µl mơi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, 370C trong vòng 1giờ.
- Cấy trải 100 µl -150 µl trên mơi trƣờng thạch LB chứa Carbenicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.
- Sản phẩm sau biến nạp đƣợc cấy trải trên mơi trƣờng có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal và IPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã đƣợc biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển đƣợc trên mơi trƣờng chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector khơng có nhận đƣợc gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thƣờng và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành
hợp chất có màu xanh. Cịn những khuẩn lạc trắng là do nhận đƣợc plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng khơng tổng hợp enzyme β-galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên khơng phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 2.8. Thành phần môi trƣờng chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp
Hóa chất Thể tích
Xgal (0,004%) 40 μl
IPTG(100 μM) 20 μl
Carbecilin(100 mg/l) 20 μl
LB đặc 20 ml
2.2.2.6. Chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp và tách plasmid
Chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp: Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào trong tế bào E.coli, chọn lọc trên mơi trƣờng LB đặc có chứa Carbecilin 100
mg/l, Xgal 0,004%, IPTG 100 μM, ủ đĩa ở 37oC trong 16h sẽ thu đƣợc khuẩn lạc xanh - trắng.
Tuy nhiên không phải bất cứ khuẩn lac trắng nào cũng là khuẩn lạc nhận đƣợc đoạn gen chúng ta quan tâm do vậy chúng ta cần tiến hành quá trình sàng lọc bằng phản ứng PCR - clony.
Lấy lƣợng phù hợp sinh khối từ khuẩn lạc lựa chọn, cho sinh khối tế bào vi khuẩn này vào trong 10 µl nƣớc khử ion. Sau đó sử dụng 3 µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với thanh phần nhƣ sau
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc
TT Thành phần và nồng độ Thể tích (µl)
1 H2O 12,8
2 Dream Taq Buffer 2,5
3 MgCl2 2,5
4 dNTPs (2,5 mM) 2,5
5 Mồi puC-18 xi (10 µM) 1,0
6 Mồi puC-18 ngƣợc (10µM) 1,0
7 Dream Taq (5 U/µl) 0,7
8 DNA 2,0
Tổng 25