STT Vùng gen
nhân bản
Ký hiệu mồi
Kích thƣớc đoạn gen nhân
bản Nhiệt độ bắt cặp mồi lý thuyết Nhiết độ bắt cặp mồi thực tế 1 rbcL P2F 750 bp 53 54 P2R 60 2 rpoB P5F 500 bp 59 54 P5R 60 3 psbA-trnH P10F 450 bp 57 56 P10R 72 4 ITS P12F 800 bp 74 57 P12R 76
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành các thí nghiệm xác định nhiệt độ bắt mồi tối ƣu nhằm nhân bản đặc hiệu các trình tự barcode của 4 cặp mồi. Bốn cặp mồi chúng tôi tiến hành nghiên cứu đƣợc thiết kế dựa theo Vijayan và Tsou (2010). Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi của 4 cặp mồi và kiểm tra kích thƣớc nhân bản thực tế của 4 gen này với 18 mẫu dó bầu. Sau quá trình thử nghiệm với các dải nhiệt độ gắn mồi khác nhau, đã xác định đƣợc nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho 4 cặp mồi nghiên cứu và kích thức nhân bản của 4 gen này so với dự đốn ban đầu có sự thay đổi thể hiện trên bảng 3.1
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ thấp không thu đƣợc sản phẩm PCR hoặc sản phẩm PCR khơng có chất lƣợng tốt. Trong khi ở nhiệt độ đặc hiệu, ở tất cả các mồi đều thu đƣợc một vạch DNA duy nhất và rõ nét. Ở ngƣỡng nhiệt độ cao khơng thu đƣợc sản phẩm PCR (hình 3.2). Nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của 4 cặp mồi dao động từ 54 - 570
C.
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR - gradient của chỉ thị rpoB ở các ngƣỡng nhiệt độ từ 49o
C tới 58oC
Trên hình 3.2 cho thấy ở các ngƣỡng nhiệt độ khác nhau cho các kết quả khác nhau ở nhiệt độ 49oC, 50oC, 51oC, 52oC không xuất hiện băng vạch, nhiệt độ 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC cho một băng vạch duy nhất tuy nhiên chỉ ở 54oC mới cho đƣợc băng vạch rõ nét còn các nhiệt độ còn lại băng vạch xuất hiện mờ khơng rõ nét, ngồi ra nhiệt độ cao hơn 57oC không thấy xuất hiện băng vạch. Do
vậy, chúng tơi xác định nhiệt độ thích hợp sử dụng trong chỉ thị này là 54oC. Và chúng tôi xác định đƣợc sản phẩm PCR sử dụng mồi rpoB có kích thƣớc khoảng
500 bp. Sản phẩm PCR thu đƣợc đƣợc tinh sạch để đọc trình tự.
Sau khi tối ƣu hóa nhiệt độ gắn mồi và các yếu tố khác chúng tôi tiến hành nhân bản bằng phản ứng PCR kết quả thu đƣợc với từng gen nhƣ sau:
3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu
3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcL
rbcL là trình tự gen nằm trong lục lạp có thể nhân bản một cách dễ dàng ở
nhiều loài thực vật. Ở các lồi khác nhau kích thƣớc của gen này cũng khác nhau, đối với cây dó bầu gen rbcL có kích thƣớc khoảng 750 bp.
Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 3.3) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu nghiên cứu, các
băng thu đƣợc đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 750 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1kb). Đây kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB
rpoB là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát sinh lồi,
đã đƣợc sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen rpoB của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả trên bản điện di cho thấy các băng đều sáng rõ và chỉ có một băng vạch duy nhất với kích thƣớc khoảng 500 bp đúng nhƣ kích thƣớc dự đốn ban đầu ở tất cả các mẫu nghiên cứu (hình 3.4).
3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnH
Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp, nhƣng thay đổi từ
296 đến 1120 bp. trnH-psbA có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã
khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần, dƣơng xỉ, rêu. Với các mẫu dó bầu nghiên cứu gen psbA-trnH có kích thƣớc vào khoảng 450 bp (hình 3.5)
Hình 3.5.Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
500 bp
3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS
ITS là gen nhân đƣợc sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định loài
ở thực vật, tuy nhiên việc nhân bản gen này thƣờng gặp khó khăn trong việc khuếch đại PCR đơn gen hoặc số lƣợng bản sao của gen ít. Kết quả nhân bản gen ITS ở cây dó bầu cho thấy gen ITS có kích thƣớc khỏang 800bp. Kết quả điện di sản phẩm
PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy các băng vạch đều sáng rõ nét và chỉ có một băng duy nhất điều này chứng tỏ quá trình nhân bản gen ITS có kết quả tốt ở cả 18 mẫu dó bầu nghiên cứu (hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS của các mẫu dó bầu nghiên cứu M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4,
T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
3.4. Kết quả tách dòng gen
3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sản phẩm PCR thu đƣợc sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất nhƣ mồi, đệm PCR, các nucleotide,...còn dƣ, và đơi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hƣởng đến kết quả của q trình tách dịng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trƣớc khi tiến hành quá trình đƣa gen vào vector tách dòng. Việc tinh sạch đƣợc thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện đƣợc nêu ở mục 2.2.2.3. Các đoạn gen sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% để kiểm tra chất lƣợng và xác định sơ bộ hàm lƣợng DNA tinh sạch, kết quả thể hiện ở hình 3.7
Hình 3.7. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen rpoB
M : thang Marker1Kb; AL2,AL6,AL8,G1,Qx,M1, PQ64, T, T2,T3, T4, T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14 : Các mẫu dó bầu nghiên cứu
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch ở hình 3.7 cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thƣớc tƣơng ứng với đoạn gen đƣợc nhân lên bằng mồi barcode tƣơng ứng. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể tiến hành phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng tiếp theo.
Tƣơng tự với các sản phẩm PCR của các gen còn lại cũng đã đƣợc tiến hành tinh sạch và cho kết quả tốt tƣơng tự gen rpoB.
3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính tốn hàm lƣợng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dịng đƣợc trình bày cụ thể ở mục 2.2.2.4. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ đƣợc thể hiện sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli.
3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α, sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung
carbenicilin 50 mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100μM. Quá trình này đƣợc trình bày 500 bp
cụ thể ở mục 2.2.2.5. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 3.8. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Hình 3.8 cho thấy kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt, trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng mật độ và số lƣợng tƣơng đối lớn đủ để qúa trình chọn lọn khuẩn lạc diễn ra dễ dàng (hình 3.8).
3.4.4 Kết quả chọn lọc dịng tế bào mang gen tái tổ hợp
Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony - PCR. Với phƣơng pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi vector pUC-18. Phƣơng pháp tiến hành cụ thể đƣợc trình bày ở mục 2.2.6 Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di trên gel 0,8%.
Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi không sử dụng các cặp mồi đã nhân bản bằng phản ứng PCR (rbcL, rpoB, ITS và psbA - trnH) vì khi thực hiện phản ứng ghép nối sản phẩm PCR đã đƣợc sử dụng một lƣợng lớn do vậy ngoài những đoạn DNA quan tâm đã đƣợc gắn vào vector pBT vẫn còn rất nhiều đoạn DNA dƣ thừa, chúng tồn tại bên trong hoặc xung quanh các khuẩn lạc
mọc trên đĩa thạch khi biến nạp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR với 4 cặp mồi trên chúng ta có thể vẫn thu đƣợc các băng vạch có kích thƣớc quan tâm tuy nhiên thực tế các đoạn DNA của chúng ta lại chƣa đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 : Các khuẩn lạc.
Mồi pUC18 đƣợc thiết kế nằm trên vector pBT và ở hai phía đối với đoạn cắt đa điểm. Khoảng cách giữa 2 mồi trên vector vào khoảng 200 bp. Do đó khi tiến hành phản ứng clony - PCR các khuẩn lạc trắng do vector tự đóng vịng sẽ thu đƣợc băng có kích thƣớc khoảng 200 bp, cịn với plasmid tái tổ hợp còn các plasmid tái tổ hợp nhận đƣợc đoạn gen sẽ có kích thƣớc bằng kích thƣớc gen cộng thêm 200 bp.
Mồi rbcL nhân lên đoạn gen barcodes có kích thƣớc vào khoảng 750 bp, kết quả điện di trên hình 3.8 xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thƣớc vào khoảng hơn 900 bp. Nhƣ vậy bƣớc đầu cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm trừ dòng số 1, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 17, 24 vì những dịng khuẩn lạc này khơng có băng vạch chúng ta quan tâm.
Các mồi còn lại cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự và đã thu đƣợc các dòng khuẩn lạc mang gen cần quan tâm.
3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Sau khi các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc ni trong 3 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này đƣợc thực hiện theo quy
trình đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.7. Plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%.
Hình 3.10. Kết quả điện di plasmid tách chiết
M : thang maker 1kb; T1,T2,T3,T4,T6,T7,T8,T9,T10,T11,T14, M1, Qx, G1, PQ64 : các plasmid của mồi rbcL
Qua kết quả điện di plasmid hình 3.10 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Để kiểm tra chính xác sự có mặt của DNA đã đƣợc biến nạp chúng tôi tiến hành xử lý plasmid thu đƣợc bằng enzyme cắt giới hạn
BamHI.
3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Các plasmid sau khi tách chiết cần tiến hành cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI để khẳng định plasmid có mang đoạn gen quan tâm hay không. Theo lý thuyết sau khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn sẽ thu đƣợc 2 phân đoạn có DNA: i) đoạn DNA đã đƣợc biến nạp và ii) phần plasmid còn lại sau khi đã mất đoạn DNA.
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI mồi rbcL.
M : thang Marker 1Kb; T1, T2, T3, T4, T6, T7, T8 : Các sản phẩm cắt của các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng BamHI ở các mẫu(T1,T2, T3, T4, T6, T7, T8)từ các plasmid đƣợc tách dòng đoạn gen rbcL cho thấy các mẫu plasmid đều phân thành hai băng trong đó có băng DNA kích thƣớc 750 bp quan tâm. Với các mẫu còn lại của mồi rbcL và 3 mồi cịn lại chúng tơi cũng thu đƣợc kết quả tƣơng tự. Các đoạn gen này đã đƣợc xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị
Các đoạn DNA sau khi đƣợc tách dịng thành cơng sẽ đƣợc gửi đọc trình tự tại cơng ty Macrogen (Công ty tham gia vào dự án giải trình tự bộ gen ngƣời). Trình tự đƣợc xác định trên máy đọc trình tự tự động theo nguyên lý của Sanger. Sau khi xử lý trình tự bằng phần mềm Bioedit và đối chiếu với những thông tin trên ngân hàng GenBank, chúng tơi đã tiến hành phân tích kết quả với cả 4 mồi nghiên cứu kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
2500 bp