TT Chất R Hoạt tính ức chế HDAC (IC
50, µM) 1 IVa 2.699 ± 0.187 2 IVb 6.363 ± 0.275 3 IVc 5.178 ± 0.608 4 IVd 4.473 ± 0.181 5 IVe 1.498 ± 0.020 6 IVf 1.794 ± 0.159 7 IVg 4.598 ± 0.273 8 IVh Cloromethyl > 10 9 IVi > 10 10 IVk 7.117 ± 0.309 SAHA 0.128 ± 0.019
3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Các sản phẩm là 10 dẫn chất N-hydroxyacrylamid mới được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên dòng tế bào ung thư phổi (SK-LU-1) tại Viện công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Kết quả giá trị IC50 cụ thể của các chất được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3. 10. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các chất IVa-k
TT Chất R IC50 (µg/mL) IC50 (µM) 1 IVa >30 >92,56 2 IVb 11,58±1,10 33,85±3,22 3 IVc 4,48±0,57 13,09±1,67 4 IVd 13,87±0,25 40,54±0,73 5 IVe 9,45±0,27 26,39±0,75 6 IVf 14,11±0,75 35,01±1,86 7 IVg 6,71±0,53 19,84±1,57 8 IVh Cloromethyl >30 >101,33 9 IVi 14,56±0,64 50,54±2,22 10 IVk 3,90±0,21 11,81±0,63 Elipticine 0,39±0,04 1,59±0,16 Ghi chú: IC50: nồng độ ức chế 50% sự phát triển
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 4.1.1. Phản ứng tổng hợp IIa-k 4.1.1. Phản ứng tổng hợp IIa-k
Các chất IIa-k được tạo thành từ phản ứng giữa 6-bromo-2H-1,4-benzoxazin- 3(4H)–on với alkyl bromid/benzyl bromid theo cơ chế thế ái nhân alkyl (SN2) với sự có mặt của K2CO3 và xúc tác KI.
Sơ đồ 4. 1. Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIa-k
Phản ứng xảy ra khá dễ dàng, hiệu suất tương đối cao trên 80%. Kiểm tra bằng SKLM cho thấy sản phẩm trung gian IIa-k thu được tương đối tinh khiết có thể sử dụng cho giai đoạn tổng hợp tiếp theo.
Phản ứng sử dụng K2CO3 tạo mơi trường base yếu, hoạt hóa 6-bromo-2H-1,4- benzoxazin-3(4H)–on từ dạng phân tử có khả năng tấn cơng kém sang dạng anion có tính ái nhân mạnh hơn. Bên cạnh đó, thêm một lượng nhỏ KI vào hỗn hợp phản ứng làm xác tác giúp tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng do tạo ra RI có khả năng tham gia phản ứng thế ái nhân nhanh hơn RBr.
Ngồi các điều kiện trên, thơng số về nhiệt độ phản cũng được nghiên cứu trong quá trình xây dựng quy trình tổng hợp. Ban đầu phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng phản ứng xảy ra chậm, các chất tham gia phản ứng không phản ứng hết. Khi tăng nhiệt độ lên khoảng 50-600C, tốc độ phản ứng tăng lên, thời gian phản ứng giảm, hiệu suất được tăng cao. Tiếp tục khảo sát ở 1000C, phản ứng sinh tạp, sản phẩm thu được khơng sạch, hiệu suất phản ứng giảm. Vì vậy, cần kiểm sốt nhiệt độ ở 50-600C để đảm bảo hiệu suất, thời gian phản ứng và theo dõi kết quả phản ứng bằng SKLM để tránh tạo sản phẩm phụ.
4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian IIIa-k
Đây là phản ứng Heck: phản ứng ghép cặp của một aryl halogenid và một olefin và tạo ra một aryl alken sử dụng palladium diacetat làm xác tác. Dẫn chất halogenid được sử dụng làm phản ứng là dẫn chất bromid do dẫn chất này có sẵn, giá thành rẻ và khả năng phản ứng tốt.
Đề tài lựa chọn palladium diacetat làm xúc tác do nó có hoạt tính xúc tác tốt, chọn lọc và bền với nhiều nhóm chức khác nhau. Ngồi ra, các xúc tác chứa Pd cịn dễ dàng thu hồi, ít lẫn tạp trong sản phẩm và có khả năng tái sử dụng cho những mẻ tiếp theo. Các xúc tác có Pd cịn có ưu điểm là chọn lọc đồng phân trans, dễ dàng cho quá trình tinh chế sau này [6]. Triphenylphosphin là phối tử được sử dụng trong phản ứng này. Đây là phối tử thông dụng, rẻ tiền, thường áp dụng với các cơ chất có hoạt tính cao như aryl bromid. Do phản ứng tạo thành acid HBr nên chúng tôi sử dụng base là TEA khan để trung hòa và tăng tốc độ phản ứng. Dung mơi DMF được sử dụng vì có khả năng hịa tan các chất tham gia phản ứng, đồng thời đây là dung môi phân cực không cho proton, được sử dụng khá phổ biến trong phản ứng Heck.
Hiệu suất phản ứng từ 65 đến 79%.
Sơ đồ 4. 2. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa-k
4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất IVa-k
Phản ứng được sử dụng để tổng hợp acid hydroxamic trong luận văn là phản ứng thế ái nhân acyl với tác nhân thế ái nhân là nhóm amin (phản ứng N-acyl hóa). Phản ứng xảy ra ở môi trường pH > 10.
Sơ đồ 4. 3. Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-k từ ester
Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-k từ ester và hydroxylamin được tiến hành với xúc tác NaOH, dung môi MeOH ở 00C trong thời gian 1 đến 2 giờ. Phản ứng diễn ra nhanh với hiệu suất thu được từ 52-72%.
Theo cơ chế phản ứng phải sử dụng tác nhân là NH2OH base; tuy nhiên dạng base khơng bền, dễ phân hủy, khó bảo quản vì vậy chúng tơi sử dụng ngun liệu ban đầu là
dạng muối NH2OH.HCl với sự có mặt của NaOH và NH2OH.HCl phải được dùng ngay. Lượng NH2OH.HCl cho vào bình phản ứng phải dư để cân bằng dịch chuyển theo chiều thuận.
Duy trì nhiệt độ thấp 00C làm cho phản ứng xảy ra nhanh và hoàn toàn, đồng thời tránh được sự thủy phân ester thành các acid carboxylic khi có mặt NaOH.
Lượng NaOH sử dụng cần dư để đảm bảo điều kiện phản ứng và chuyển NH2OH.HCl thành dạng NH2OH tự do đồng thời trong quá trình phản ứng tạo muối với acid hydroxamic, giúp sản phẩm tạo thành tan hết trong dịch phản ứng. Tuy nhiên, lượng NaOH dư có nhược điểm là tạo mơi trường kiềm mạnh sẽ làm các ester IIIa-k dễ bị thủy phân tạo tạp là các acid carboxylic rất khó để loại bỏ. Vì vậy cần tiến hành phản ứng trên trong điều kiện nhiệt độ thấp đồng thời NaOH được cho từ từ vào bình phản ứng để tránh nhiệt độ tăng lên đột ngột làm phân hủy NH2OH tự do.
Cần lưu ý thời gian, nhiệt độ phản ứng, kiểm tra phản ứng thường xuyên bằng sắc ký lớp mỏng và thử phản ứng màu với FeCl3/HCl để xác định thời điểm kết thúc phản ứng và tránh tạo sản phẩm phụ.
4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
10 chất trong luận văn sau khi tổng hợp xong đều được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C. Dữ liệu các loại phổ được trình bày trong mục 3.1.3 và phổ đồ trong phần phụ lục. Sau đây là môt số bàn luận về việc xác định cấu trúc thông qua các dữ liệu phổ.
4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại bản chất là phổ dao động của các nhóm chức trong phân tử, cho thông tin về đỉnh hấp thụ của các kiểu dao động trong các nhóm chức. Phổ đồ của các chất đều bao gồm hai vùng: vùng nhóm chức và vùng vân tay. Các chất IVa-k trong luận văn đều là những chất phức tạp, vì vậy phổ hồng ngoại chứa rất nhiều dải hấp thụ khác nhau, đặc biệt là dải hấp thụ trong vùng vân tay rất khó biện giải cho từng nhóm chức. Vì vậy, chùng tơi tập trung phân tích phổ vùng nhóm chức để xác định sản phẩm tạo ra với các nhóm chức đặc trưng.
Có thể nhận dạng sơ bộ sự xuất hiện của một số nhóm chức, một số liên kết thơng qua các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (phụ lục). Cụ thể:
- Tất cả 10 chất IVa-k đều có vân hấp thụ của dao động hóa trị liên kết O-H trong nhóm chức acid hydroxamic (3240-3183 cm-1)
- Trong cấu trúc có liên kết –NH-CO-, nên phổ hồng ngoại của tất cả các chất đều xuất hiện vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O trong nhóm chức amid từ 1682 – 1643
cm-1. Trên phổ đồ của một số chất (IVd, IVe, IVf, IVg) có thể quan sát thấy vân hấp thụ của dao động hóa trị liên kết N-H (3300-3291 cm-1).
- Trên phổ đồ của các chất cũng quan sát thấy dao động hóa trị của các liên kết C=C vịng thơm từ 1618 – 1558 cm-1 và C-H vòng thơm từ 2992 – 2918 cm-1.
- Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp được cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị của –CH2- của hầu hết các chất với số sóng 2853 – 2762 cm-1
ngoại trừ 2 chất IVe, IVf.
Như vậy, dữ liệu phổ IR đã cho thấy một số nhóm chức và liên kết trong cấu tạo của các chất đã tổng hợp, phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của 10 chất IVa-k. Tuy nhiên, phổ IR chưa thể cung cấp đầy đủ thông số để khẳng định cấu trúc của các chất. Để khẳng định cấu trúc của các chất cần nghiên cứu thêm các số liệu của phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Dưới đây là hình ảnh minh họa phổ hồng ngoại của chất IVg:
Hình 4. 1. Phổ hồng ngoại của chất IVg
4.2.2. Phổ khối lượng (MS)
Các chất được đo phổ khối lượng ở chế độ phun mù điện ESI (-) và ESI (+). Trên phổ đồ của mỗi chất đều xuất hiện pic ion có số khối bằng [M-H]- (IVa-g, IVi-k) và [M+H]+ (IVh). Ngoài ra trên phổ đồ của chất IVe, IVf xuất hiện pic của ion đồng vị của nhóm thế: 37Cl là đồng vị của 35Cl, 81Br là đồng vị của 79Br.
Phân tích phổ đồ của chất IVe làm ví dụ. Chất IVe có cơng thức dự kiến là C18H15ClN2O4 tương ứng với số khối là 358,0720. Phổ đồ của chất IVe (hình 4.2) cho thấy pic ion phân tử có cường độ mạnh nhất là của đồng vị 35Cl với số khối 357,0652; ngoài ra cịn có pic của đồng vị 37Cl với cường độ bằng khoảng 1/3 so với pic của đồng
vị 35Cl và các pic phân mảnh khác có cường độ yếu hơn. Như vậy, có thể sơ bộ khẳng định được chất IVe có số khối đúng như số khối dự kiến.
Hình 4. 2. Phổ khối lượng của chất IVe
4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Để khẳng định chắc chắn cấu trúc, ngoài dữ liệu phổ hồng ngoại và phổ khối lượng, 10 chất tổng hợp được còn được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân được trình bày trong mục 3.1.3.3 và 3.1.3.4 và phần phổ đồ trong phần phụ lục. Sau đây là một số bàn luận dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ để chứng minh cấu trúc các chất tổng hợp.
4.2.3.1. Phổ 1H - NMR
Trên phổ đồ của các chất (phụ lục 1-2 đến 10-2) ta nhận thấy:
Proton –OH và –NH trong nhóm chức acid hydroxamic xuất hiện trên phổ đồ của 8 chất IVa-g và IVk dưới dạng singlet (s) với độ dịch chuyển hóa học trong khoảng: 10,71 – 10,73 ppm (với -OH) và 8,99 – 9,02 ppm (với –NH). Hai chất IVh và IVi khơng xuất hiện tín hiệu của proton –NH và -OH có thể do các proton rất linh động, dễ dàng bị trao đổi hoặc hỗ biến nên khơng xuất hiện trên phổ đồ. Nhóm NH gần nhóm C=O hơn nhóm OH do đó bị ảnh hưởng nhiều hơn bởi hiệu ứng hút điện tử của nhóm carbonyl. Vì vậy, trên phổ đồ, proton nhóm NH cộng hưởng ở vùng trường yếu hơn, nhóm OH cộng hưởng ở vùng trường mạnh hơn.
Các proton của cấu trúc benzoxazin và dẫn chất thế benzyl xuất hiện rõ ràng trên phổ đồ:
+ Các chất IVa-g có các proton H5’, H7’, H2’’, H3’’, H4’’, H5’’, H6’’ trong các vịng thơm nằm trong vùng dịch chuyển hóa học từ 7,55 – 7,05 ppm và tín hiệu có dạng
multiplet (m) gồm 6;7 hoặc 8 vạch. Proton H-8’ có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,03 - 7,06 ppm, tín hiệu dạng doublet (d), hằng số tương tác J = 8,00 – 8,50 Hz (IVa, IVb, IVd-g)
+ Các chất IVh-k có proton H-5’ có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 7,40 – 7,47 ppm, tín hiệu dạng singlet (s). Proton H-7’, H-8’ có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng lần lượt là: 7,22 – 7,25 ppm và 7,01 – 7,04 ppm; tín hiệu đều ở dạng doublet (d); hằng số tương tác J = 7,00 – 8,50 Hz
+ Proton methylen trong cấu trúc benzoxazin (H-2’a, H-2’b)xuất hiện pic ở cả 10 chất với độ dịch chuyển hóa học: 4,66 – 4,86 ppm; tín hiệu dạng singlet (s).
+ Có 9 chất tổng hợp được xuất hiện pic của nhóm – CH2 - với độ dịch chuyển hóa học: 3,84 - 5,22 ppm, tín hiệu dạng singlet (s) (IVa-g) hoặc doublet (d) (IVi, IVk); hằng số tương tác J = 6,00 – 7,00 Hz.
Các proton trên nối đôi acrylamid được xác định rõ ràng trên phổ đồ
+ Proton H-3 có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng: 7,05 – 7,43 ppm (IVa-g) và 7,44 – 7,50 ppm (IVh-k); tín hiệu dạng doublet (d) do tương tác với các proton bên cạnh, hằng số tương tác J = 15,50 – 16,50 Hz.
+ Proton H-2 có vùng dịch chuyển hóa học từ: 6,27 - 6,28 ppm (IVa-g) và 6,39 – 6,42 (IVh-k), tín hiệu có dạng doublet (d) do tương tác với H-3, hằng số tương tác
J=15,50 – 16,00 Hz. Ta có thể khẳng định phản ứng Heck đã xảy ra và tổng hợp đúng các chất ở dạng cấu hình E
Ngồi ra, trên phổ đồ của một số chất xuất hiện pic của dẫn chất thế:
+ Phổ đồ chất IVg có thêm pic của nhóm –CH3 trên vịng benzyl với độ dịch chuyển hóa học là 2,26 ppm; tín hiệu dạng singlet (s).
+ Phổ đồ chất IVh xuất hiện pic của các cụm proton H-1’’a, H-1’’b, H-2’’a, H-2’’b với độ dịch chuyển hóa học 3,68-3,95 ppm; hằng số tương tác J = 5,25-6,75 Hz).
+ Chất IVi xuất hiện pic của các cụm proton: H-1’’; H-2’’a, H-2’’b, H-3’’a, H3’’b với độ dịch chuyển hóa học lần lượt 1,12-1,14 ppm và 0,46 – 0,55 ppm; tín hiệu dạng multiplet (m).
+ Chất IVk có các cụm proton H-1”, H-2”a, H-2”b, H-3”a, H-3”b, H-4”a, H-4”b, H-5”a, H-5”b, H-6”a, H-6”b với độ dịch chuyển hóa học 1,14 – 1,65 ppm, tín hiệu dạng multiplet.
Ví dụ trên phổ đồ của chất IVa (hình 4.3) có thể thấy xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với các proton như đã phân tích với cường độ mạnh và rõ nét.
Hình 4. 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR của chất IVa
4.2.3.2. Phổ 13C - NMR
Phổ 13C-NMR cho thơng tin trực tiếp về khung carbon, tồn bộ carbon trong phân tử các chất đều cho tín hiệu rõ ràng dạng mũi tên đơn do được khử hoàn tồn tương tác spin-spin do đó việc xác định cấu trúc dễ dàng hơn.
Trên phổ đồ 13C-NMR của IVa (hình 4.4) có thể thấy xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với số lượng C trong công thức C18H16N2O4 với cường độ mạnh và sắc nét.
Như vậy, kết hợp kết quả phân tích các phổ IR, MS, 1H – NMR, 13C-NMR có thể khẳng định 10 chất đã tổng hợp được IVa-k có cơng thức cấu tạo hồn tồn đúng như dự kiến.
4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.3.1. Tác dụng ức chế HDAC
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, các dẫn chất IVa-g và IVk cho tác dụng ức chế HDAC yếu hơn SAHA 14 đến 55 lần. Chất IVh, IVi chưa thể hiện tác dụng ở nồng độ thử nghiệm. Có thể thấy, các chất có nhóm thể là alkyl (IVh,i,k) trên vịng benzoxazin cho tác dụng ức chế HDAC yếu hơn các chất có nhóm thế là các benzyl.
Khi so sánh tác dụng ức chế HDAC của các hợp chất có cùng nhóm –F được gắn vào vịng benzyl ở các vị trí lần lượt là 2-F, 3-F, 4-F thì chất IVd (3-F) cho tác dụng mạnh nhất với IC50 là 4,473 µM.
Với các nhóm thế khác nhau được gắn vào cùng vị trí số 4 trên vịng benzyl (4- F, 4-Cl, 4-Br, 4-CH3) thì chất cho tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất là IVe (4-Cl) với giá trị IC50 là 1,498 µM.
Khi so sánh kết quả ức chế HDAC của các chất IVa-k với các chất 17a-m đã tổng hợp được trong luận án Tiến sỹ của Dương Tiến Anh [2], chúng tôi nhận thấy: