CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.3. Phương pháp làm tiêu bản tổ chức tuyến sinh dục và đọc kết quả
+ Phương pháp làm tiêu bản tổ chức tuyến sinh dục:
Tuyến sinh dục sau khi được cố định trong formaldehyde 10% sẽ được tiến hành làm tiêu bản tổ chức học, quy trình được tiến hành qua 5 bước như sau:
Chuẩn bị mẫu: Mẫu tuyến sinh dục được đưa ra khỏi dung dịch cố định, rửa và
methyl salicylate 12-24 giờ. Sau cùng, mẫu được thấm trong parafin nóng chảy ở 650C trong thời gian ít nhất 6 giờ.
Đúc mẫu trong parafin: Sử dụng máy đổ parafin đã nóng chảy vào khn đã
chứa mẫu, để trên dàn lạnh khoảng 30 phút cho mẫu parafin đông cứng lại. Dùng dao gọt khối parafin chứa mẫu thành hình thang hoặc hình chữ nhật để dễ cắt lớp.
Cắt lát mẫu: Dùng dao gọt khối parafin chứa mẫu thành hình thang hoặc hình
chữ nhật để dễ cắt lớp. Khối parafin được gắn lên đế gỗ sau đó đế gỗ được gắn vào máy microtome, cắt lát có độ dày 5 -7 μm. Đưa lát cắt vào nước ấm (40 – 450C) khoảng 1-2 phút để lát cắt giãn, không bị nhăn. Dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và sấy trên máy sấy ở nhiệt độ từ 45 – 600C trong 1 – 4 giờ.
Nhuộm Hematoxin và Eosin: Tiếp theo, mẫu được khử parafin bằng cách ngâm trong dung dịch xylen và làm trương nước bằng cách nhúng trong dung dịch ethanol ở các nồng độ khác nhau khoảng 2-3 phút, bằng dung dịch Xylen I và Xylen II lần lượt mỗi dung dịch trong 5 phút, bước 2 là làm mẫu trương nước bằng cách nhúng trong dung dịch Ethanol ở các nồng độ khác nhau khoảng 2-3 phút (Ethanol 100% từ 2 - 3 phút, Ethanol 95% từ 2 - 3 phút, Ethanol 80% từ 2 - 3 phút, Ethanol 50% từ 2 - 3 phút, mỗi nồng độ sẽ lặp lại 2 lần). Mẫu được nhúng nước 3 - 6 lần. Cuối cùng, mẫu được nhuộm trong dung dịch Hematoxin - Mayer trong 4 - 6 phút rồi rửa qua nước chảy nhẹ 4 - 6 phút và nhuộm Eosin trong 2 phút.
Làm trong mẫu: Để thuận tiện trong việc quan sát, các tiêu bản được ngâm trong dung dịch Xylen I, II trong 2 - 3 phút, để khô và đậy lamen bằng keo dán Baume (Canada). Ghi nhãn trên lamen là khâu cuối cùng của quy trình.
+ Đọc kết quả trên kính hiển vi:
Tiêu bản tổ chức học tuyến sinh dục sẽ được quan sát trên kính hiển vi Olympus, ở vật kính 10. Đường kính nỗn bào được đo bằng trắc vi thị kính gắn trên thị kính, ở vật kính 10. Kích thước nỗn bào ở mỗi pha được đo trên 15 nỗn bào, và được tính theo cơng thức:
L = 0.1 * (A/n) Trong đó: L: Chiều dài thực của noãn bào (mm) A: Số vạch đếm được trên trắc vi thị kính n: Bội giác của vật kính