CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn và MIC của cao chiết từ vỏ quả mãng cầu ta
Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vỏ quả mãng cầu ta (Annona squamosa L.) đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau và thử nghiệm với 6 loại vi khuẩn gây bệnh bao gồm: 3 vi khuẩn Gram dương Staphylococus aureus, Bacillus cereus, Listeria sp. và 3 vi khuẩn Gram âm Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sp.
Bảng 5. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết vỏ quả mãng cầu ta
Nồng độ chất kháng
(mg/mL)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
S. aureus B. cereus Listeria sp Shigella sp E. coli S. typhimurium 800 11.86bA±0.02 12.10bB±0.07 10.39bC±0.05 10.24bD±0.13 9.56bE±0.01 11.25bF±0.02 400 10.59cA±0.03 10.27cB±0.07 8.87cC±0.01 8.41cD± 0.06 8.87cD±0.01 9.40cE±0.05 100 9.22dA±0.04 9.62dB±0.18 8.67 dC±0.04 7.55dD±0.05 8.34dE±0.02 8.42 dE±0.06 50 8.32eA±0.03 9.16eB±0.06 6.39 eC±0.05 6.25eC±0.08 7.22eD±0.03 7.47eE±0.18 25 6.50fA±0.06 6.44fA±0.10 - - 7.04fB±0.03 6.94fC±0.03 10 - - - Đối chứng âm - - - - - - DMSO5% - - - - - - Gentamycin 10μg/đĩa 16.80aA±0.05 25.42aB±0.73 19.25aC±0.05 19.40aD±0.08 19.23aC±0.87 15.90aE±0.09 Chú thích: -: không kháng khuẩn;
Các kí tự in hoa A, B, C, D, E, F khác nhau trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0.05. Các kí tự in thường a, b, c, d, e, f khác nhau trong cùng một cột có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0.05. G: Gentamycin; D: DMSO 5%.
32
Hình.2 Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của cao chiết vỏ mãng cầu ta.
Chú thích: A: S. aureus; B: B. cereus; C: Listeria sp; D: Shigella sp; E: E. coli; F: S. typhimuriumi; G: gentamycine. Các số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tương ứng với nồng độ (mg/mL) 800, 400, 100, 50, 25,10 maltodextrin, DMSO 5%.
Trong nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vỏ mãng cầu ta (Annona
squamosa L.), mẫu được pha loãng bằng dimethyl sulfoxide 5%. Dimethyl sulfoxide (viết
tắt là DMSO) là hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh, có công thức phân tử là (CH3)2SO. Đây là chất lỏng trong suốt không màu, không mùi, có độ phân cực cao cũng như điểm sôi cao. Nó là một dung môi hữu cơ phổ biến có khả năng hòa tan mạnh nhất, có thể hòa tan hầu hết các hợp chất hữu cơ bao gồm carbohydrate, polymer, peptide, cũng như nhiều muối vô cơ và đưa chúng về nồng độ nhất định mà không gây ra các phản ứng với chất cần hòa tan (Brayton, C. F. (1986). Dựa trên kết quả thí nghiệm với đĩa giấy kháng khuẩn có tẩm DMSO 5% là chứng âm, ta thấy chất này không có khả năng kháng khuẩn với toàn bộ vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả này tương đồng với hầu hết các nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn trên nguyên liệu là cao chiết từ thực vật, và đều sử dụng DMSO làm chất pha loãng mẫu. Điển hình như nghiên cứu của Alzoreky et al.,(2003), cao chiết từ 26 loài thực
vật ở châu Á được pha loãng với DMSO 5% thành các nồng độ khác nhau và dùng DMSO 5% làm chứng âm. Kết quả cho thấy, chứng âm này không kháng lại các chủng vi khuẩn thử nghiệm, trong đó có Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria sp., Escherichia coli.
Cao chiết với ethanol và nước từ rễ cây Landolphia owerrience cũng được pha loãng với
33 nghiệm, bao gồm cả Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi và Bacillus
subtilis (Okeke et al., 2001). Vì vậy có thể kết luận rằng DMSO hòa tan đa số các hợp chất
không ảnh hưởng đến kết quả kháng khuẩn và cũng không làm thay đổi hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết.
Kết quả trên cho thấy chứng dương Gentamycin có khả năng kháng đối với 6 chủng vi khuẩn thí nghiệm. Với nồng độ Gentamycin giống nhau là 10 μg/đĩa nhưng khả năng kháng khuẩn với từng loại vi khuẩn là khác nhau. Thứ tự các vi khuẩn thí nghiệm nhạy cảm với chứng dương Gentamycin lần lượt là: Bacillus cereus (25.42 mm) > Shigella sp. (19.40 mm) > Listeria spp. (19.25 mm) > E. coli (19.23 mm), S. aureus (16.80 mm) > S. typhimurium (15.90 mm). Trong đó, B. cereus và Shigella sp. bị tác động bởi kháng sinh này với đường kính vòng kháng không có sự khác biệt (Okeke et al., 2001). Kháng sinh
Gentamycin có khả năng kháng khuẩn cao là nhờ vào sự ức chế tổng hợp protein và phá vỡ toàn bộ màng tế bào vi khuẩn. Quá trình này bao gồm việc khuếch tán qua màng ngoài và hấp thụ tế bào chất, sau đó, Gentamycin sẽ di chuyển nhanh chóng để gắn kết ribosom của vi khuẩn, làm ức chế tổng hợp protein. Ngoài ra cũng làm giảm độ chính xác của các RNA thông tin, dẫn đến kết hợp sai các acid amin trong chuỗi polypeptid của vi khuẩn (Zembower et al., 1998; Begg và Barclay, 1995).
Đối với cao chiết thì MIC của S. aureus, B. cereus, E. coli, S. typhimurium là 25 mg/ml, của
Listeria sp. và Shigella sp. là 50 mg/ml. Ở nồng độ 800 mg/ml, khả năng kháng khuẩn của
cao chiết trên vi khuẩn B. cereus là cao nhất với đường kính vòng kháng đạt 12.10 mm, sau đó là đến S. aureus với đường kính là 11.86 mm. Khả năng kháng của cao chiết giảm dần từ
S. typhimurium, Listeria spp., Shigella sp. và cuối cùng là E. coli (9.56 mm). Khi giảm dần
nồng độ, đường kính vòng kháng khuẩn cũng giảm dần và đến nồng độ 50 mg/ml, cao chiết vẫn còn khả năng kháng với toàn bộ vi khuẩn thử nghiệm. Tuy nhiên, MIC đối với Listeria
spp.và Shigella spp. chỉ dừng tại đây, 4 chủng còn lại thì cao chiết vẫn có khả năng kháng
đến nồng độ 25 mg/ml. Điều này cho thấy, cao chiết có khả năng kháng lại S. aureus, B. subtilis, E. coli, S. typhimurium tốt hơn Listeria sp., Shigella sp..
Cao chiết từ vỏ mãng cầu ta có khả năng kháng khuẩn cao hơn cao chiết từ lá xoài (Mangifera indica L.) trên các vi khuẩn S. typhimurium, S. aureus và E. coli (MIC là 100 mg/ml đối với S. typhimurium,75 mg/ml ở S. aureus và E. coli, trong khi đó, MIC của cao
chiết từ vỏ mãng cầu đối với các chủng này là 25 mg/ml). Tuy nhiên, đối với B. cereus thì khả năng kháng khuẩn của hai loại cao chiết này là bằng nhau và đối với vi khuẩn Shigella
34 spp. thì khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá xoài là cao hơn (MIC là 25 mg/ml, trong khi MIC của cao vỏ mãng cầu là 50 mg/ml) (Doughari et al., 2008). Nghiên cứu của Adesokan
et al.,(2007) đã cho thấy khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vỏ cây Enantia chlorantha
với MIC là 50 mg/ml đối với các chủng vi khuẩn S. aureus, B. subtilis, E. coli, S. typhimurium. Cao chiết này có nồng độ tối thiểu kháng khuẩn thấp hơn gấp hai lần so với
cao vỏ mãng cầu (25 mg/ml). Ở nghiên cứu của Kachhawa et al.,(2012), cao chiết từ vỏ cây mãng cầu (Annona squamosa L.) có khả năng kháng lại hai chủng vi khuẩn Bacillus, E. coli với MIC là 100 mg/ml, tương ứng với đường kính vòng kháng là 8 mm. Điều này cho thấy, đối với vi khuẩn Bacillus, E. coli thì khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vỏ quả mãng
cầu tốt hơn vỏ cây.
Khả năng kháng khuẩn của vỏ quả mãng cầu ta có thể là do các hợp chất sinh học như: tannins, saponins, steroids, terpenoids, coumarins tạo ra. Điển hình như tannins là polymer phenolic có tính thuộc da, làm kết tủa các hợp chất từ dung dịch. Tannins đã được chứng minh là độc hại đối với nấm sợi, nấm men và vi khuẩn. Tannins liên kết với thành tế bào của vi khuẩn, do đó gây ra ứ đọng enzyme protease và ức chế hoạt động của vi khuẩn (Omojate, 2014).
Các cơ chế khác nhau đề xuất cho đến nay để giải thích hoạt động kháng khuẩn tannin bao gồm ức chế các enzyme ngoại bào của vi khuẩn, làm mất các chất nền cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật hoặc hoạt động trực tiếp lên quá trình chuyển hóa của vi sinh vật thông qua ức chế quá trình phosphoryl oxy hóa (Scalbert, A. (1991). Chúng gây ức chế trên màng của tế bào vi khuẩn bằng cách tương tác với protein giàu proline trong các hạt nhỏ hoặc trên axit lipoteichoic bề mặt tế bào vi khuẩn, sau đó ức chế phosphoryl hóa oxy hóa bởi ty thể, dẫn đến ngăn cản sự vận chuyển điện tử trong tế bào vi khuẩn, từ đó làm tế bào yếu đi và chết (Buzzini, 2008).
Saponins ức chế sự phát triển bằng cách gây ra sự thay đổi ở thành tế bào của vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, saponins với liều thấp có thể làm tăng tính thấm của màng tế bào một cách có kiểm soát, do đó cho phép tăng sự hấp thụ các chất vào tế bào vi khuẩn (Wang et al., 2000). Phương thức hoạt động chung của saponins đối với vi sinh vật là sự
tương tác của chúng với hợp chất sterol - hiện diện trong màng của động vật nguyên sinh (Williams AG & Coleman GS, 1997)). Như vậy, hoạt động chống nguyên sinh của saponins có thể là do phá hủy màng tế bào, gây rò rỉ vật chất bên trong tế bào. Hàm lượng saponins trong chiết xuất thực vật có thể khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguyên liệu,
35 phương pháp chiết xuất, bảo quản,... điều này giúp giải thích sự khác biệt trong ảnh hưởng của của saponins lên vi khuẩn mặc dù với hàm lượng tương tự. Ngoài ra, saponins có thể không được chiết xuất hoàn toàn từ nguyên liệu thực vật (Hostettmann K & Marston A, 1995), Wallace et al.,2004) kết luận từ nghiên cứu của họ rằng vi khuẩn Gram dương mẫn
cảm hơn so với vi khuẩn Gram âm với sự hiện diện của saponins.
Nhiều nghiên cứu cho thấy steroids có khả năng kháng khuẩn do tác động lên bề mặt tế bào vi khuẩn theo hai mô hình: mô hình 'thảm' và 'nòng súng' (Shai, Y. ,1999). Trong mô hình thảm, steroids liên kết với bề mặt tế bào (thông qua tương tác ion) và khi đạt nồng độ, toàn bộ các mảng của màng bị loại bỏ. Trong mô hình nòng súng, steroids tập hợp lại thành các bó trong màng, giống như các nòng súng, tạo thành nhiều lỗ nhỏ trong màng. Tất cả các tác động này đều làm tốc độ khử cực màng tăng lên và các chất kích thích vi khuẩn được kích hoạt. Màng tế bào vi khuẩn dần vỡ ra, dẫn đến việc nguyên sinh chất tràn ra ngoài và làm chết vi khuẩn (Savage, 2002).
Coumarins có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn như S.aureus, E. coli, S. typhimurium…là nhờ vào sự ức chế một số DNA của vi khuẩn (Lee et al.,2003). Một trong
những enzyme mà coumarins ức chế là DNA gyrase của vi khuẩn. Cụ thể, các coumarins ngăn cản hoạt động trong quá trình sao chép DNA, xúc tác quá trình thủy phân ATP liên quan đến phản ứng enzyme (Parker, 2001). Bên cạnh coumarins, terpenoids được đánh giá là có khả năng kháng khuẩn cao. Terpenoids tác động lên màng plasma của vi khuẩn và gây loãng màng trên quy mô lớn, can thiệp vào một số quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Bên cạnh đó, chúng còn tác động lên quá trình truyền tín hiệu hoặc con đường biểu hiện gen, gây ra sự xáo trộn màng tế bào dẫn đến phá vỡ màng (Omojate Godstime, 2014).
Qua quá trình nghiên cứu, có thể thấy được khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ vỏ quả mãng cầu ta vượt trội hơn so với nhiều loại cao chiết từ thực vật khác. Vỏ mãng cầu là một loại nguyên liệu tiềm năng trong ứng dụng vào các nghiên cứu tạo ra kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả hơn các loại kháng sinh hiện tại.