PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Bố trí thí nghiệm
Diễn giải Lô I Lô II
Giống lợn LY Duroc Số lƣợng con (con) 5 5 Tuổi bắt đầu TN (năm) 2 2 P.bình quân TN (kg) 200-220 200-220 Thời gian thí nghiệm (tháng) 4 4
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo phƣơng pháp phân lô so sánh, lợn thí nghiệm khỏe mạnh, khối lƣợng tƣơng đối bằng nhau, khơng có dị tật đều đƣợc tiêm phòng vaccine theo lịch tiêm phòng của trại, đảm bảo các yếu tố và điều kiện chăm sóc đồng đều nhƣ khối lƣợng, độ tuổi, thức ăn, chăm sóc ni dƣỡng,…
20
3.4.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp theo dõi các chỉ tiêu
1. Khảo sát quy trình khai thác tinh nhân tạo.
Sơ đồ nghiên cứu quy trình khai thác tinh nhân tạo.
2. Đánh giá chất lƣợng tinh dịch đực giống
+ Các chỉ tiêu kiểm tra bằng mắt thƣờng: màu sắc, thể tích
+ Các chỉ tiêu kiểm tra qua kính hiển vi: nồng độ, hoạt lực, sức kháng của tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kỳ hình, chỉ tiêu tổng hợp VAC.
- Chỉ tiêu về hiệu quả phối giống: Tỷ lệ nái thụ thai, khối lƣợng trung bình con sơ sinh, số con sơ sinh/ổ, số con còn sống sau 24h.
Vật liệu nghiên cứu:
- Dụng cụ thí nghiệm: Cân đồng hồ 1-100kg ±100g
Dụng cụ lấy tinh
- Giá nhảy bằng xi măng hoặc sắt - Phễu lọc
Dụng cụ kiểm tra phẩm chất và lưu trữ tinh dịch
- Cốc đong, ống đong có chia vạch,…
- Kính hiển vi thƣờng có vật kính độ phóng đại 10×10; 40×10; 100×10 - Hóa chất: Nacl 1%, Nacl 3%, nƣớc cất
- Buồng đếm hồng cầu Newbouwer
Tinh dịch lợn Đánh giá chất
lƣợng tinh dịch Lựa chọn mẫu tinh
đạt chất lƣợng
Bảo quản tinh dịch
Nghiên cứu về quy trình sản xuất tinh nhân tạo, đánh giá chất lƣợng tinh
dịch sau bảo quản
Dẫn tinh cho lợn nái
Đánh giá hiệu quả phối giống
21 - Lamen
- Ống nhỏ giọt, Pipet 5ml, Pipet 0,1 ml - Đũa khuấy thủy tinh, nhiệt kế
- Một số dụng cụ hỗ trợ cho việc kiểm tra phẩm chất tinh dịch có tại cơ sở khảo sát nhƣ: Kính hiển vi, cốc đong có vạch chia độ, máy đo nồng độ,…
3.4.2.1. Kiểm tra bằng mắt thường các chỉ tiêu
* Phƣơng pháp kiểm tra:
+ Lơ thí nghiệm đƣợc kiểm tra lấy các mẫu số liệu 8 ngày khai thác 1 lần, trung bình 4 mẫu/tháng
- Màu sắc:
Thơng thƣờng, tinh dịch lợn có màu trắng sữa, trắng xám hay trắng trong
Quan sát bằng mắt thƣờng để ghi nhận những màu sắc của tinh dịch, đặc biệt chú ý đến những màu sắc khác thƣờng.
- Thể tích (V: ml): Là thể tích của tồn bộ tinh dịch thu đƣợc sau khi lọc bỏ keo phèn.
Dùng lọ có chia vạch chỉ thể tích để đo thể tích tinh dịch thu đƣợc
Chú ý: khi đọc kết quả cần đặt lọ tinh trên một mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở mặt cong của tinh dịch.
3.4.2.2. Kiểm tra dưới kính hiển vi các chỉ tiêu a. Nồng độ tinh dịch (C: triệu/ml tinh dịch)
- Phƣơng pháp đếm trực tiếp bằng buồng Newbouwer tiến hành nhƣ sau: Dùng lá kính khơ, sạch của buồng đếm lắp lên mặt buồng đếm.
Dùng ống hút bạch cầu (khô và sạch) hút tinh nguyên đến vạch 0,5, sau đó hút dung dịch NaCl 3% đến vạch 11. Dùng ngón tay cái và trỏ bịt hai đầu ống hút, đảo nhẹ 3 – 4 lần trong ống hút. Nhƣ vậy dung dịch đó đã đƣợc pha lỗng 20 lần. Sau đó bỏ đi vài giọt rồi 1 giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị trƣớc.
Đƣa buồng đếm lên kính hiển vi để đếm tinh trùng. Đếm 4 ơ ở 4 góc và 1 ơ ở giữa (mỗi ơ trung bình có 16 ơ con, mỗi ơ con có diện tích 1/4000 mm3 ).
Cơng thức tính: C = N x 106 Trong đó
C: nồng độ tinh trùng trong tinh dịch (triệu/ml) N: số tinh trùng đếm đƣợc
22
Nhƣ vậy, đếm đƣợc bao nhiêu tinh trùng thì nồng độ tinh trùng là bấy nhiêu triệu trong 1ml tinh nguyên.
b. Hoạt lực tinh trùng (A – số tinh trùng vận động tiến thẳng/ml tinh dịch) Đánh giá chất lƣợng tinh dịch thông qua ƣớc lƣợng tỷ lệ % tinh trùng tiến thẳng hoặc mức độ “sóng động” của mặt thống vi trƣờng tinh dịch do sức hoạt động của tinh trùng tạo nên.
Ƣớc lƣợng tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng trong một vi trƣờng dƣới kính hiển vi. Thực hiện: nhỏ 1 giọt tinh dịch (đã sƣởi ấm ở 38- 40oC) lên lame đã ổn định ở 38- 40oc, quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phụng đại 100 lần, ƣớc lƣợng tỉ lệ % tinh trùng tiến thẳng, sau đó đánh giá theo thang điểm.
Chú ý: Để có kết quả chính xác.
- Cần kiểm tra ngay sau khi lấy tinh - Chú ý đến nhiệt độ kiểm tra.
23
Bảng 3.1. Thang điểm đánh giá hoạt lực và tỷ lệ tiến thẳng của tinh trung (Vũ Đình Tơn,2005[11])
c. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình (K %)
Những tinh trùng có hình thái khác thƣờng ở đầu, cổ, thân và đi thƣờng khơng có khả năng thụ thai
Tiến hành: dùng phƣơng pháp phết tiêu bản - Dàn mỏng 1 giọt tinh bằng 2 lame
- Làm khô tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn
- Nhuộm tiêu bản bằng xanh Methylen 5 %, để khoảng 5 - 7 phút. - Rửa tiêu bản dƣới vịi nƣớc, sau đó làm khơ.
- Quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần và đếm từ 300 đến 500 tinh trùng một cách ngẫu nhiên để biết số tinh trùng bình thƣờng và khơng bình thƣờng, tính ra tỉ lệ. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là: K % = × 100 Trong đó: n: là số tinh trùng kỳ hình N: tổng số tinh trùng đếm đƣợc (N = 300 – 500) d. Sức kháng của tinh trùng (R)
Sức kháng của tinh trùng thể hiện sức đề kháng của tinh trùng với dung dịch muối đẳng trƣơng NaCl 1%. Tức là lƣợng dung dịch NaCl cần thiết để pha lỗng một đơn vị thể tích tinh dịch cho đến khi các tinh trùng ngừng tiến thẳng. Tính sức kháng của tinh trùng theo công thức sau:
R = V v
Trong đó: - V là thể tích của dung dịch NaCl 1% đã sử dụng để pha loãng - v là thể tích tinh dịch dùng kiểm tra
Điểm 5 4 3 2 1
Tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng (%)
24
Phƣơng pháp xác định: Ngƣời ta dùng phƣơng pháp pha chuyển qua 3 lọ để xác định sức kháng tinh trùng lợn ngoại và phƣơng pháp pha chuyển qua 2 lọ để xác định sức kháng tinh trùng lợn nội.
* Phương pháp pha chuyển qua 3 lọ
Rót dung dịch NaCl 1% vào lọ I: 5ml; lọ II: 1ml; lọ III: 0,5ml. Cho 0,01 ml tinh nguyên vào lọ I, lắc nhẹ trộn đều (mức pha loãng trong lọ I là 500 lần). Hút 1ml từ hỗn hợp trong lọ I cho sang lọ II, lắc nhẹ, trộn đều (mức pha loãng trong lọ II là 1000 lần). Hút 0,5 ml từ lọ II sang lọ III, lắc nhẹ, trộn đều (mức pha loãng trong lọ III là 2000 lần).
Lấy 1 giọt hỗn hợp trong lọ III đặt lên phiến kính để kiểm tra sức hoạt động tinh trùng. Nếu thấy có tinh trùng tiến thẳng thì thêm 0,1 ml NaCl 1% vào lọ III (mức pha loãng sẽ là 2.200 lần). Lại kiểm tra hoạt lực của tinh trùng. Nếu có tinh trùng tiến thẳng lại pha thêm 0,1 ml NaCl 1% (mức pha lỗng 2.400 lần có nghĩa R = 2400) cứ tiếp tục cho đến khi tinh trùng ngừng tiến thẳng.
Cơng thức tổng qt tính R:
R = r0 + r.n
R: sức kháng của tinh trùng với dung dịch NaCl 1%
r0: mức pha loãng của tinh dịch taị thời điểm kiểm tra hoạt lực (trong trƣờng hợp trên r0 = 2000)
r: mức pha loãng mỗi lần thêm NaCl 1% (r = 200 lần) n: số lần thêm NaCl vào thêm
25 e. Chỉ tiêu tổng hợp VAC
Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch VAC ( tỷ/lần lấy tinh) VAC =V (ml) x A x C ( tỷ tinh trùng/ml)
- Phƣơng pháp tiến hành:
+ Lần lƣợt xác định các chỉ tiêu V, A, C của tinh nguyên, tinh pha loãng, tinh bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, tinh bảo quản lạnh rồi tính tích các hệ số.
+ Dựa vào chỉ tiêu tổng số tinh trùng tiến thẳng để quyết định số liều tinh sản xuất.
- Chỉ tiêu tổng hợp VAC: Là tổng số tinh trung tiến thẳng trong một lần xuất tinh, sản xuất ra liều tinh đảm bảo cho đực giống vẫn có khả năng sản xuất.
n=
Trong đó:
n: số liều tinh sản xuất
N: số tinh trùng cần có trong liều phối để con cái thụ thai tốt nhất
3.4.2.3. Chỉ tiêu về hiệu quả phối giống
Phƣơng pháp phối giống: Phối lại 2 lần mỗi con trong mỗi lần phối giống, theo dõi kết quả phối giống trên đàn nái thí nghiệm.
a. Tỷ lệ nái thụ thai (%)
Tỷ lệ thụ thai là số nái thụ thai trên tổng số nái đƣợc phối Tỷ lệ thụ thai =
× 100
b. Khối lƣợng con sơ sinh
Là chỉ tiêu đánh giá khả năng nuôi thai của lợn mẹ khả năng sinh trƣởng của thai cũng nhƣ sức sống của thai ở thời kì trong bụng mẹ. Khối lƣợng sơ sinh/ổ phụ thuộc vào yếu tố giống. Các giống lợn ngoại có khối lƣợng sơ sinh/ổ cao hơn so với giống lợn nội nƣớc ta. Khối lƣợng sơ sinh/ổ còn phụ thuộc vào yếu tố dinh dƣỡng của lợn nái trong thời kì chửa, nhất là trong giai đoạn chửa cuối.
c. Khối lƣợng trung bình con sơ sinh
- Khối lƣợng trung bình sơ sinh (kg/con): Là khối lƣợng lợn con đƣợc cân ngay sau khi đẻ ra, đã đƣợc cắt rốn, lau khô, bấm số tai và trƣớc khi cho bú lần đầu tiên.
26 d. Số con đẻ ra/ổ (con)
- Số con đẻ ra/ổ (con): Là số con đƣợc sinh ra của ổ đẻ kể cả con sống và chết, đƣợc tính khi lợn mẹ đẻ con cuối cùng. Đếm tổng số con đẻ ra đối với cả lơ thí nghiệm.
e. Số con còn sống đến 24h(con)
Là số con đẻ ra còn sống đến khi đẻ xong con cuối cùng. Tỷ lệ sống của đàn con (%) = số con còn sống đến 24h x 100
Số con đẻ ra
3.4.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
27
PHẦN 4: KẾT QUẢ
4.1. So sánh phẩm chất tinh dịch một số giống lợn đực thí nghiệm
Các chỉ tiêu đánh giá về số lƣợng và chất lƣợng tinh dịch phản ánh sức khỏe và khả năng truyền giống của lợn đực. Việc kiểm tra này cho phép ta kết luận tinh dịch của lợn đực giống có đủ tiêu chuẩn để phối cho đàn nái hay khơng. Quy trình kiểm tra đƣợc tiến hành tại phịng thí nghiệm, pha chế tinh dịch lợn của Trung tâm giống vật ni tỉnh Phú Thọ và phịng thí nghiệm khoa học động vật trƣờng Đại học Hùng Vƣơng với hai giống LY và Duroc.
4.1.1. Kết quả kiểm tra màu sắc tinh dịch của lợn thí nghiệm
Bảng 4.1: Kết quả màu sắc tinh dịch Màu sắc Màu sắc
Đực giống n Trắng trong Trắng xám Trắng sữa
Màu sắc khơng bình
thƣờng
LY 40 1 3 36 0
Duroc 40 0 1 39 0
Quan sát 80 mẫu tinh dịch thì màu sắc của tất cả các mẫu đều bình thƣờng, 75/80 các mẫu tinh dịch có màu trắng sữa, 4 mẫu có màu trắng xám và 1 mẫu giống LY có màu trắng trong.
Theo Nguyễn Tấn Anh, Đỗ Hữu Hoan (2006), cho rằng màu sắc tinh dịch phải có trạng thái đồng nhất, khơng có màu sắc khác thƣờng, thƣờng có màu trắng sữa (có nồng độ tinh trùng cao) hoặc trắng xám (có nồng độ tinh trùng trung bình) nhƣ vậy so với kết quả với kết quả thu đƣợc, ta thấy màu sắc các mẫu tinh dịch đều đạt yêu cầu.
4.1.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu V, A, C chất lượng tinh dịch đực giống
Với các đực giống đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch V, A, C tiến hành so sánh các chỉ tiêu giữa hai giống LY và Duroc. Kết quả thể hiện ở bảng 4.2
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu V, A, C chất lƣợng tinh dịch đực giống
Chỉ tiêu Tháng Giống N Mean SE Min Max
V (ml) 1 Duroc 20 306,75 a 3,04 287 330 LY 20 243,40b 2,21 220 257 2 Duroc 20 302,90 a 3,08 280 325 LY 20 242,90b 2,92 220 280
28 A (%) 1 Duroc 20 0,83 a 0,01 0,8 0,88 LY 20 0,82b 0,01 0,7 0,92 2 Duroc 20 0,83 a 0,01 0,78 0,88 LY 20 0,83a 0,01 0,7 0,87 C (triệu/ml) 1 Duroc 20 304,12 a 3,84 257,67 322 LY 20 287,97b 2,81 252,33 305 2 Duroc 20 305,23 a 3,66 260,67 322 LY 20 289b 1,96 275 306,33
Ghi chú: Trong cùng một tháng những giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ( P < 0,05).
Kết quả thể tích
Qua khai thác tinh dịch của lợn đực giống, thể tích tinh dịch trung bình của lợn giống Duroc ở thời điểm tháng 1 là 306,75 ± 3,04 ml lớn hơn so với lƣợng tinh khai thác lợn LY là 243,40 ± 2,21 ml. Sang tháng 2, mức thể tích dao động khơng cao hơn tháng 1, giống lợn đực giống Duroc có khả năng sản xuất lƣợng tinh tốt hơn so với lợn đực LY lần lƣợt là 302,90 ± 3,08 ml và 242,90 ± 2,92 ml. Thể tích tinh dịch của hai giống lợn dao động từ 240 – 300 ml
Theo Nguyễn Thiện và Cs (2006), thì lƣợng tinh dịch thu đƣợc ở lợn có nhiều biến động lớn. Lƣợng tinh dịch xuất ra thƣờng phụ thuộc vào: giống heo, tình trạng sức khỏe, tần số lấy tinh, các tác nhân kích thích trong khi lấy tinh,…do đó sự khác nhau giữa hai giống của tơi về lƣợng tinh khai thác đƣợc có thể do nguyên nhân trên.
Kết quả hoạt lực
Xác định thực tế hoạt lực của 80 mẫu tinh dịch tại phịng thí nghiệm, kết quả hoạt lực tinh trùng thể hiện bảng 4.2 qua bảng ta thấy hoạt lực trung bình của tinh dịch đạt >0,8 là khá cao.
Hoạt lực trung bình của lơ Duroc tƣơng đƣơng so với lô lợn đực giống LY ở cả 2 tháng thí nghiệm, đạt cao nhất (A = 0,83 ± 0,01), nhóm lơ lợn LY có hoạt lực thấp nhất (A = 0,82 ± 0,01).
Theo Trần Tiến Dũng (2000), thì hoạt lực của tinh trùng cịn đƣợc gọi là sức hoạt động, nó cho thấy khả năng thụ thai cuả tinh trùng. Qua kết quả khảo sát đƣợc, ta thấy các mẫu tinh heo tại trại có sức hoạt động lớn, do đó khả
29 năng thụ thai cao.
Kết quả nồng độ
Nồng độ tinh trùng của lợn giống Duroc tháng 1 là 304,12 ± 3,84 triệu/ml, tháng 2 là 305,23 ± 3,66 triệu/ml. Lợn giống LY tháng 1 là 287,97 ± 2,81 triệu/ml, tháng 2 là 289 ± 1,96 triệu/ml. Sự chênh lệch nồng độ giữa các giống do nguyên nhân từ khí hậu, mơi trƣờng , sự thích nghi với điều kiện ngoại cảnh của các giống lợn là khác nhau. Trong thời gian thí nghiệm tháng 1 có đợt khơng khí lạnh có thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng tinh dịch lợn đực giống khi không đƣợc vận động ngoài trời lạnh.
Theo kết quả nghiên cứu của Gottasdi L.L (1980); Ito Niwa (1984)nồng độ tinh trùng của lợn Landrace là 245±39,14; Large White là 227±18,24; Nguyễn Thiện và cs (1976) chỉ tiêu này của Landrace từ 200-260 tr/ml; Lê Quang Long (1976). Nồng độ tinh trùng ở lợn Landrace 196 tr/ml; Yorkshire 112 tr/ml, thì kết quả nghiên cứu của tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả trên.
Tuy nhiên, kết quả theo dõi nồng độ tinh trùng của hai giống lợn của em cao hơn tiêu chuẩn Nhà nƣớc (TCVN 2002/67): nồng độ tinh trùng yêu cầu C= 200-270 triệu/ml.
4.1.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu R, K chất lượng tinh dịch đực giống
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu R, K chất lƣợng tinh dịch đực giống
Chỉ tiêu Tháng Giống N Mean SE Min Max
R 1 Duroc 20 3720 a 96,7 3200 4800 LY 20 4040b 116 3200 4800 2 Duroc 20 3640 a 95,8 3200 4400 LY 20 4080b 107 3200 4800 K (%) 1 Duroc 20 4,89 a 0,08 4,33 5,58 LY 20 6,53b 0,11 5,25 7,25 2 Duroc 20 5,86 a 0,17 4,42 7,58 LY 20 7,41b 0,14 6,1 8,58
Ghi chú: Trong cùng một tháng những giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê ( P < 0,05).
Từ kết quả khảo sát của chúng tôi thu đƣợc tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trong tinh dịch lợn giống Duroc tháng 1 là 4,89 ± 0,08%, tỷ lệ kỳ hình của tinh