CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.3. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của tiểu bào tử mướp đắng đến sự phát sinh
sinh callus
3.3.1. Xác định giai đoạn phát triển của tiểu bào tử
Năm 2014, Daryono và cs nghiên cứu trên cây đậu nành đã đánh giá giai đoạn phát triển của tiểu bào tử dựa vào chiều dài của nụ hoa. Cụ thể, giai đoạn đơn nhân muộn chiếm 57,15% trong toàn bộ giai đoạn của nụ hoa dài 2,5 – 3,5 mm (Daryono và et al, 2014). Tương tự, trong Đường kính và chiều dài nụ hoa đều có mối tương quan đáng kể với chiều dài bao phấn và các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử. Trong mỗi trường hợp, bao phấn dài ra có mối tương quan tốt hơn đáng kể so với chiều dài chồi, điều này cung đã được chỉ ra ở nghiên cứu trên cây cà chua của (Adhikari và cs, 2017).
Theo Nizeki và Oono (1968) thì tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân muộn là vật liệu tốt nhất cho q trình ni cấy bao phấn lúa, tuy nhiên, Clapham (1971) xác định rằng hiệu suất tạo cây đại mạch cao nhất đạt được ở giai đoạn đơn nhân sớm. Trong nghiên cứu này, 6 giai đoạn phát triển khác nhau của tiểu bào tử bao gồm giai đoạn phân bào, đơn nhân sớm, đơn nhân giữa, đơn nhân muộn (khơng bào), hai nhân và hạt phấn (hình) với đường kính tương ứng được thể hiện trong (bảng 3.4).
Tiểu bào tử đơn nhân sớm (Hình B3, B4) cho thấy hình dạng chưa ổn định, thành tế bào mỏng, hạt nhân lớn. Ở giai đoạn này, đường kính nụ hoa tăng mạnh đến 2.76 ± 0.12 mm, trong khi đó bao phấn chuyển sang màu xanh nhạt, đục (Hình B1, B2) kích thước thay đổi khơng đáng kể 2.23±0.11 mm (bảng 3.4).
Tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân giữa (Hình C3, C4) cho thấy sự khác biệt rõ ràng so với giai đoạn đơn nhân sớm, chủ yếu là nhân tế bào nằm ở trung tâm, hạt nhân bắt màu đậm và sáng hơn nội chất tế bào, có hình cầu. Những thay đổi này tương quan với những thay đổi hình thái của nụ hoa bao gồm kích thước nụ hoa tăng và cánh hoa bắt đầu mở (Hình C1). Kích thước bao phấn tăng mạnh đến 3.09±0.2 mm (bảng 3.4), bao phấn xanh ngả vàng nhạt với bề mặt căng bóng (Hình C2).
Tiểu bào tử đơn nhân muộn có hình cầu, nhân nằm lệch về một phía của tế bào, hình thành khơng bào (Hình D3, D4). Ở giai đoạn này, cánh hoa xuất hiện và đường kính nụ tăng về kích thước (Hình D1, Bảng), tuy nhiên bao phấn (Hình D2) vẫn duy trì hình thái với chiều dài thay đổi nhưng khơng có sự khác biệt về thống kê (bảng 3.4).
Tiểu bào tử hai nhân có một nhân sinh sản nhỏ và một nhân sinh dưỡng lớn hơn (Hình E3, E4). Tế bào chất trong hạt phấn được làm giàu thêm dẫn đến trở nên dày đặc
16
từ giai đoạn đơn nhân muộn sang hai nhân và hạt phấn được đặc trưng bởi sự gia tăng mạnh về kích thước bao phấn và sự xuất hiện cánh hoa lên khỏi đài hoa (Hình D1, E1, F1). Chiều dài nụ hoa có xu hướng tăng nhẹ nhưng khơng có sự khác biệt về thống kê (bảng 3.4).
Hình 3.2. Mối quan hệ giữa nụ hoa và bao phấn với các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử mướp đắng(Momordica charantiaL.)
A1 B1 C1 E2 F2 F2 E1 F1 D1 A2 B2 C2 D2 D4 E2 C4 B4 A4 C3 B3 C2 D3 E3 E3
18
Chú thích: Sự thay đổi hình thái nụ hoa và bao phấn ở các khoảng kích thước khác nhau: Hình A1-F1 (thanh tỷ lệ= 2,0 mm) đại diện cho các nụ hoa. Hình A2-F2 (thanh tỷ lệ= 1 mm) đại diện cho bao phấn tương ứng được tách ra từ nụ hoa. A1 3,0 – 4,0 mm; A2 4,0 – 4,9 mm; A3 5,0 – 5,9 mm; A4 6,0 – 6,9 mm; A5 7,0 – 7,9 mm; A6 8,0 – 10 mm. Các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử: A3-F3: Hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi quang học. A4-F4: Hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. A3, A4: Giai đoạn phân bào; B3, B4: Giai đoạn đơn nhân sớm; C3, C4: Giai đoạn đơn nhân giữa; D3, D4: Giai đoạn đơn nhân muộn; E3, E4: Giai đoạn hai nhân; F3, F4: Hạt phấn.
Qua hình 3.2 cho thấy tiểu bào tử ở bốn giai đoạn của sự phát triển đều có mặt trong nụ có kích thước 4,0-4,9 mm, tiểu bào tử đơn nhân sớm chiếm 44%, các đơn nhân giữa chứa 37.66%, tỷ lệ đơn nhân muộn tương ứng là 11.33%, và hai nhân là 5.33%. Trong nụ hoa có kích thước 5.1 - 6.0 mm, bốn giai đoạn phát triển của tiểu bào tử được tìm thấy với một ưu thế lên đến 71,67% là đơn nhân giữa . Trong bao phấn của nụ hoa có kích thước 6.1 - 7.0 mm, tìm thấy tiểu bào tử có bốn giai đoạn phát triển với một tỷ lệ ưu thế hơn các giai đoạn còn lại là đơn nhân muộn chiếm 59,33%. Tuy nhiên, thường có một giai đoạn phát triển chiếm ưu thế, kết quả này cung tương đồng với kết quả nghiên cứu ở một số loài khác như mướp đắng hay ớt (Nguyen và cs, 2019; Gonza và cs, 2013). Đối với mướp đắng, các nụ hoa dài 4,0 – 4,5 mm chứa tiểu bào tử ở bốn giai đoạn khác nhau gồm đơn nhân sớm, đơn nhân giữa, đơn nhân muộn và hai nhân với tỉ lệ lần lượt là 60,19±2,32%; 24,08±0,98%; 14,99±1,8%; 0,74±0,74%.
Đối với chiều rộng nụ hoa, có ít nghiên cứu sử dụng thơng số này làm tiêu chí lựa chọn giai đoạn tiểu bào tử. Yi và cs (2019) đã báo cáo rằng sự phát triển phôi tốt nhất trong nuôi cấy tách rời tiểu bào tử cỏ linh lăng đến từ giai đoạn đơn nhân muộn với chiều dài nụ hoa 6,02 – 6,20 mm và chiều rộng 1,50 – 1,72 mm(Yi et al, 2019). Adhikari và cs (2017) đã đưa ra mối tương quan giữa kích thước nụ hoa (chiều dài và chiều rộng) và bao phấn (chiều dài) với sự phát triển của tiểu bào tử ở cây cà chua Campari (Adhikari et al, 2017).
Do đó, khi ni cấy tiểu bào tử khơng xác định được kích thước bao phấn với một giai đoạn phát triển tiểu bào tử, ta cung có thể chọn nụ, trong đó bao phấn giai đoạn tối ưu chiếm ưu thế.
Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của nụ hoa và bao phấn STT Chiều dài nụ hoa (mm) Đường kính nụ hoa (mm)
Chiều dài bao phấn(mm) Giai đoạn phát triển chính của tiểu bào tử Đặc điểm nụ hoa Đặc điểm bao phấn
1 3 - 4 1.83±0.06a 2.16±0.05a Phân bào Đài hoa bao
phủ các phần Xanh đậm, trong 2 4.0 - 4.9 2.76±0.12b 2.23±0.11a Đơn nhân sớm Xanh nhạt, đục 3 5.0 - 5.9 3.38±0.09b 3.09±0.2b Đơn nhân giữa Cánh hoa dần tách màng Xanh, vàng nhạt 4 6.0 - 6.9 3.74±0.21bc 3.31±0.23b Đơn nhân muộn Vàng nhạt, trong
5 7.0 - 7.9 3.92±0.27b 3.85±0.34bc Hai nhân Cánh hoa hoàn thiện, mở nhỏ
Vàng nhạt, đục
6 8.0 - 10 4.40±0.33b 4.57±0.41bcd Hạt phấn Vàng đậm
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05.
20
Chiều dài nụ hoa (mm)
Hình 3.3.Tỷ lệ phần trăm giai đoạn phát triển của tiểu bào tử mướp đắng
3.3.2. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của tiểu bào tử đến sự phát sinh callus
Chiều dài nụ hoa được xem như một tiêu chí để đánh giá giai đoạn phát triển của tiểu bào tử ảnh hưởng đến sự cảm ứng phát sinh callus. Nghiên cứu cảm ứng phát sinh callus trong nuôi cấy bao phấn cây cà chua (Solanum lycopersicum), Seguí-simarro và cs (2005) cung đã đánh giá mối liên hệ giữa giai đoạn phát triển tiểu bào tử với chiều dài nụ hoa nhằm chọn ra giai đoạn phù hợp nhất cho q trình ni cấy. Trong đó, giai đoạn đơn nhân muộn được quan sát ở các nụ hoa dao dộng trong khoảng 8 mm đến 13 mm, tập trung nhất là các nụ hoa dài 10 mm với tỷ lệ 74,3%.
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của tiểu bào tử đến sự phát sinh callus Kích thước nụ hoa(mm) Tỷ lệ callus phát sinh từ tiểu bào tử (%)
5,0 - 6,0 0
6,1 - 7,0 0
7,1 - 8,0 27±26.67
Qua (hình 3.3) , kết quả cho thấy các nụ hoa ở kích thước 7.1 - 8,0 mm tìm thấy bào tử chỉ có ba giai đoạn phát triển (đơn nhân giữa, đơn nhân muộn và hai nhân) với tỷ lệ 55% của giai đoạn 2 nhân, 32,67% là giai đoạn đơn nhân muộn. Trong phạm vi 5,0 mm đến 6,0 mm và 6,1 mm -7,0 mm khơng có sự hình thành callus (bảng). Theo nghiên cứu của M.Usman và cộng sự (2015) kích thước trung bình (13-15) mm cho khả năng phát sinh callus tốt nhất (Usman, Bakhsh, Fatima, Zaman, & Shah, 2015). Năm 2011, Salas và cs đã khẳng định rằng mối tương quan rõ ràng giữa chiều dài nụ hoa và các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử ở cà tím. Kết quả nghiên cứu ở giống cà tím Bandera cho thấy tỷ lệ giai đoạn đơn nhân muộn (41,1%) thuộc nụ hoa có chiều dài 12,0 – 12,9 mm là cao nhất (Salas và et al, 2012).
3.4. Đánh giá quá trình phát triển của tiểu bào tử và sự hình thành callus trong mơi trường ni cấy
Q trình phát triển của tiểu bào tử và sự hình thành callus đã được theo dõi và định kỳ quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi soi nổi. Tại thời điểm nuôi cấy, môi trường nuôi cấy chứa phần lớn tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân muộn và hai nhân.
Tiểu bào tử trong môi trường nuôi cấy sau 24h, dấu hiệu đầu tiên của sự cảm ứng được phát hiện bằng sự xuất hiện của các mầm hình thành từ tiểu bào tử. Tiểu bào tử sau khi hình thành mầm, tiếp tục phân chia tế bào từ ống mầm đó. Các tiểu bào tử sau khi phân chia có những xu hướng khác nhau: các tiểu bào tử liên kết lại với nhau khơng hình thành callus hoặc hình thành nên cấu trúc callus, một số ngừng phát triển sau một phân chia, một số tiếp tục phát triển theo con đường giao tử, trở thành các cấu trúc giống hạt phấn trưởng thành. Các quan sát tương tự đã được báo cáo cho cây củ cải đường (Han và cs, 2014) (hình 3.4).
22
Hinh 3.4.Quá trình hình thành callus từ tiểu bào tử mướp đắng(Momordica charantiaL.) Qua 7 ngày ni cấy tiểu bào tử hình thành mầm, tiếp tục phân chia tế bào từ ống mầm và có xu hướng liên kết lại với nhau tạo thành cụm(hình 3.4, A, B, C). Sau 21 ngày ni cấy, dấu hiệu đầu tiên của sự cảm ứng phát sinh callus được phát hiện bằng sự xuất hiện hình thái callus ngay trong các cụm tiểu bào tử (hình 3.4, D), hình thái callus hồn chỉnh được quan sát sau 30 ngày(hình 3.4, E, F). Các quan sát tương tự đã được báo cáo cho cây củ cải đường (Han et al, 2014). Các callus khi hoàn chỉnh cấu trúc được chuyển sang mơi trường rắn. Ngồi ra, một số lượng tiểu bào tử nhất định không cho thấy bất kỳ sự thay đổi về mặt hình thái so với lúc cấy ban đầu và một số tế bào bị chết hay ngừng phát triển. Điều này tương tự được chỉ ra trong nghiên cứu của (Seguı et al, 2012; Soriano et al, 2013).
3.5. Đánh giá hình thành và phát triên của callus trong mơi trường ni cấy
Q trình phát triển của callus được theo dõi và định kỳ quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi soi nổi.
A B C
Hình 3.3. Hình thái của callus mướp đắng thay đổi qua từng khoảng thời gian
(Momordica charantiaL.)
Callus khi hồn chỉnh cấu trúc kích thước dần tăng và hình thái sẽ thay đổi, cụ thể ở (hình 3.5) Area= 3,59mm2 (A) kết khối chặt, màu trắng tinh thể, dạng cứng. 21 ngày tiếp theo kích thước tăng Area= 4.87 (B) , kết khối chặt chẽ, màu vàng dạng cứng. Kích thước callus phát triển đạt cao nhất Area= 24,17mm2(C), mẫu được cấy chuyển sang môi trường MS rắn (0,8% agar, 30 g sucrose / L) chứa 1mg/L BAP (D) trong phịng được kiểm sốt nhiệt độ ở 25 ° C (hình 3.3). Tuy nhiên, vì được chuyển sang mơi trường nảy mầm ở giai đoạn sớm, các callus dẫn đến sư phat triển khơng đạt, kết quả tương tự được tìm thấy trong nghiên cứu ni cấy tiểu bào tử phát sinh callus từ củ cải (Tuncer, 2017).
A B C
24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Sáu giai đoạn phát triển khác nhau của tiểu bào tử mướp đắng bao gồm giai đoạn phân bào, đơn nhân sớm, đơn nhân giữa, đơn nhân muộn, hai nhân và hạt phấn đã được quan sát.
Đường kính và chiều dài nụ hoa đều có mối tương quan đáng kể với chiều dài bao phấn và các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử.
Kích thước nụ hoa từ 7,1 đến 8,0 mm cảm ứng phát sinh cao nhất với sự phát triển của tiểu bào tử ở giai đoạn hai nhân chiếm tỷ lệ 55% và 32,67% là giai đoạn đơn nhân muộn.
Tỷ lệ phát sinh callus cao nhất thu được khi ni cấy tiểu bào tử ở nụ hoa có kích thước từ 7,1 đến 8,0 mm trên mơi trường MS có 30g/l đường saccharose, pH 5,7 - 5,8; nồng độ chất kích thích sinh trưởng 0.91 mg/l BAP; 1mg/l 2,4D ở nhiệt độ 32,50C.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy tiểu bào tử cho từng loại kiểu gen.
Tiếp tục hồn thiện quy trình cấy chuyển callus mướp đắng để duy trì callus đã thu được.
Tiếp tục nghiên cứu tăng sinh số lượng callus phát sinh từ tiểu bào tử và nghiên cứu tái sinh chồi thu được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bailey, C. J., Day, C., & Leatherdale, B. A. (1986). Traditional treatments for diabetes from Asia and the West Indies.Practical Diabetes International,3(4), 190-192.
Raman, A., & Lau, C. (1996). Anti-diabetic properties and phytochemistry of Momordica charantia L. (Cucurbitaceae).Phytomedicine,2(4), 349-362.
Dans, A. M. L., Villarruz, M. V. C., Jimeno, C. A., Javelosa, M. A. U., Chua, J., Bautista, R., & Velez, G. G. B. (2007). The effect of Momordica charantia capsule preparation on glycemic control in type 2 diabetes mellitus needs further studies.Journal of clinical epidemiology,60(6), 554-559.
Agarwal, M. (2015). Tissue culture of Momordica charantia L.: A review. J Plant Sci, 3,
24-32.
Ích, Đ. H., Chung, Đ. Q., Chương, B. X., Dong, N. T., Đàm, Đ. T., Hiền, P. V., ... & Thu, Đ. T. (2003). Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II.Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang,335.
Barro, J. G.-H. and F. (2009) ‘Production of Doubled Haploids in Brassica’, in
Advancesin Haploid Production in Higher Plants, pp. 65–73.
Biddington, N. L. (1992) ‘The influence of ethylene in plant tissue culture’, Plant GrowthRegulation, 11, pp. 173–187.
Blackmore, S. et al. (2007) ‘Pollen wall development in flowering plants’,
NewPhytologist, 174(3), pp. 483–498. doi: 10.1111/j.1469-8137.2007.02060.x.
Bureau, I. (2017) ‘Method for producing haploid, dihaploid and doubled haploid plantsby isolated microspore culture’,World Intellectual Property Organization, (12).
Chun, C. (2011) ‘Microspore-derived Embryo Formation in Response to Cold Pretreatment , Washing Medium , and Medium Composition of Radish ( Raphanussativus L .)’,Kor. J. Hort. Sci. Technol, 29(5), pp. 494–499.
Chun, C., Park, H. and Na, H. (2011) ‘Microspore-Derived Embryo Formation in Radish( Raphanus sativus L .) According to Nutritional and Environmental Conditions’, Hort.Environ. Biotechnol., 52(5), pp. 530–535. doi: 10.1007/s13580-011-
0080-1
Xuan Nguyen, T., & Song, Y. S. (2017). Sự tạo cây vơ tính thơng qua ni cấy bao phấn ở cây dâu tây phản ứng trung tính với ánh sáng. Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, (2), 279.
26
Dandawate, P. R., Subramaniam, D., Padhye, S. B., & Anant, S. (2016). Bitter melon: a panacea for inflammation and cancer.Chinese journal of natural medicines,14(2),
81-100.
Sagor, A. T., Chowdhury, M. R. H., Tabassum, N., Hossain, H., Rahman, M. M., & Alam, M. A. (2015). Supplementation of fresh ucche (Momordica charantia L. var. muricata Willd) prevented oxidative stress, fibrosis and hepatic damage in CCl 4 treated rats.BMC complementary and alternative medicine,15(1), 1-9.
Phạm Hoàng Hộ(1991),Cây cỏ Việt Nam,Tập 2(quyển 1), Nxb Trẻ,tr.568-713.
Tạ Duy Chân (1999), Những phương thuốc hay “chữa bệnh bằng hoa”, Nhà xuất bản Nghệ An, trang 161 – 255.
Ích, Đ. H., Chung, Đ. Q., Chương, B. X., Dong, N. T., Đàm, Đ. T., Hiền, P. V., ... & Thu, Đ. T. (2003). Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang, 335.
Đỗ Tất Lợi (1991), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT, Hà Nội.
Loi, D. T. (1991). Nhung cay thuoc va vi thuoc Viet Nam (Glossary of Vietnamese Medicinal Plants and Drugs).
Chi, V. V. (2005). Cây rau, trái đậu dùng để ăn và trị bệnh.
Raina, K.; Kumar, D.; Agarwal, R. Promise of bitter melon (Momordica charantia) bioactives in cancer prevention and therapy. Semin. Cancer Biol. 2016, 40–41,
116–129.
Fang, E.F.; Froetscher, L.; Scheibye-Knudsen, M.; Bohr, V.A.; Wong, J.H.; Ng, T.B. Emerging Antitumor Activities of the Bitter Melon (Momordica charantia). Curr. Protein ,Pept. Sci. 2019, 20, 296–301.