Đánh giá hình thành và phát triên của callus trong- 123docz.net

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.5. Đánh giá hình thành và phát triên của callus trong môi trường nuôi cấy

Quá trình phát triển của callus được theo dõi và định kỳ quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi soi nổi.

A B C

Hình 3.3. Hình thái của callus mướp đắng thay đổi qua từng khoảng thời gian

(Momordica charantiaL.)

Callus khi hoàn chỉnh cấu trúc kích thước dần tăng và hình thái sẽ thay đổi, cụ thể ở (hình 3.5) Area= 3,59mm2 (A) kết khối chặt, màu trắng tinh thể, dạng cứng. 21 ngày tiếp theo kích thước tăng Area= 4.87 (B) , kết khối chặt chẽ, màu vàng dạng cứng. Kích thước callus phát triển đạt cao nhất Area= 24,17mm2(C), mẫu được cấy chuyển sang môi trường MS rắn (0,8% agar, 30 g sucrose / L) chứa 1mg/L BAP (D) trong phòng được kiểm soát nhiệt độ ở 25 ° C (hình 3.3). Tuy nhiên, vì được chuyển sang môi trường nảy mầm ở giai đoạn sớm, các callus dẫn đến sư phat triển không đạt, kết quả tương tự được tìm thấy trong nghiên cứu nuôi cấy tiểu bào tử phát sinh callus từ củ cải (Tuncer, 2017).

A B C

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận

Sáu giai đoạn phát triển khác nhau của tiểu bào tử mướp đắng bao gồm giai đoạn phân bào, đơn nhân sớm, đơn nhân giữa, đơn nhân muộn, hai nhân và hạt phấn đã được quan sát.

Đường kính và chiều dài nụ hoa đều có mối tương quan đáng kể với chiều dài bao phấn và các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử.

Kích thước nụ hoa từ 7,1 đến 8,0 mm cảm ứng phát sinh cao nhất với sự phát triển của tiểu bào tử ở giai đoạn hai nhân chiếm tỷ lệ 55% và 32,67% là giai đoạn đơn nhân muộn.

Tỷ lệ phát sinh callus cao nhất thu được khi nuôi cấy tiểu bào tử ở nụ hoa có kích thước từ 7,1 đến 8,0 mm trên môi trường MS có 30g/l đường saccharose, pH 5,7 - 5,8; nồng độ chất kích thích sinh trưởng 0.91 mg/l BAP; 1mg/l 2,4D ở nhiệt độ 32,50C.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra điều kiện và thành phần môi trường nuôi cấy tiểu bào tử cho từng loại kiểu gen.

Tiếp tục hoàn thiện quy trình cấy chuyển callus mướp đắng để duy trì callus đã thu được.

Tiếp tục nghiên cứu tăng sinh số lượng callus phát sinh từ tiểu bào tử và nghiên cứu tái sinh chồi thu được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bailey, C. J., Day, C., & Leatherdale, B. A. (1986). Traditional treatments for diabetes from Asia and the West Indies.Practical Diabetes International,3(4), 190-192. Raman, A., & Lau, C. (1996). Anti-diabetic properties and phytochemistry of Momordica

charantia L. (Cucurbitaceae).Phytomedicine,2(4), 349-362.

Dans, A. M. L., Villarruz, M. V. C., Jimeno, C. A., Javelosa, M. A. U., Chua, J., Bautista, R., & Velez, G. G. B. (2007). The effect of Momordica charantia capsule preparation on glycemic control in type 2 diabetes mellitus needs further studies.Journal of clinical epidemiology,60(6), 554-559.

Agarwal, M. (2015). Tissue culture of Momordica charantia L.: A review. J Plant Sci, 3, 24-32.

Ích, Đ. H., Chung, Đ. Q., Chương, B. X., Dong, N. T., Đàm, Đ. T., Hiền, P. V., ... & Thu, Đ. T. (2003). Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II.Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang,335.

Barro, J. G.-H. and F. (2009) ‘Production of Doubled Haploids in Brassica’, in

Advancesin Haploid Production in Higher Plants, pp. 65–73.

Biddington, N. L. (1992) ‘The influence of ethylene in plant tissue culture’, Plant GrowthRegulation, 11, pp. 173–187.

Blackmore, S. et al. (2007) ‘Pollen wall development in flowering plants’,

NewPhytologist, 174(3), pp. 483–498. doi: 10.1111/j.1469-8137.2007.02060.x. Bureau, I. (2017) ‘Method for producing haploid, dihaploid and doubled haploid plantsby

isolated microspore culture’,World Intellectual Property Organization, (12). Chun, C. (2011) ‘Microspore-derived Embryo Formation in Response to Cold

Pretreatment , Washing Medium , and Medium Composition of Radish ( Raphanussativus L .)’,Kor. J. Hort. Sci. Technol, 29(5), pp. 494–499.

Chun, C., Park, H. and Na, H. (2011) ‘Microspore-Derived Embryo Formation in Radish( Raphanus sativus L .) According to Nutritional and Environmental Conditions’, Hort.Environ. Biotechnol., 52(5), pp. 530–535. doi: 10.1007/s13580-011-

0080-1

Xuan Nguyen, T., & Song, Y. S. (2017). Sự tạo cây vô tính thông qua nuôi cấy bao phấn ở cây dâu tây phản ứng trung tính với ánh sáng. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, (2), 279.

Dandawate, P. R., Subramaniam, D., Padhye, S. B., & Anant, S. (2016). Bitter melon: a panacea for inflammation and cancer.Chinese journal of natural medicines,14(2), 81-100.

Sagor, A. T., Chowdhury, M. R. H., Tabassum, N., Hossain, H., Rahman, M. M., & Alam, M. A. (2015). Supplementation of fresh ucche (Momordica charantia L. var. muricata Willd) prevented oxidative stress, fibrosis and hepatic damage in CCl 4 treated rats.BMC complementary and alternative medicine,15(1), 1-9.

Phạm Hoàng Hộ(1991),Cây cỏ Việt Nam,Tập 2(quyển 1), Nxb Trẻ,tr.568-713.

Tạ Duy Chân (1999), Những phương thuốc hay “chữa bệnh bằng hoa”, Nhà xuất bản Nghệ An, trang 161 – 255.

Ích, Đ. H., Chung, Đ. Q., Chương, B. X., Dong, N. T., Đàm, Đ. T., Hiền, P. V., ... & Thu, Đ. T. (2003). Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật, trang, 335.

Đỗ Tất Lợi (1991), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT, Hà Nội.

Loi, D. T. (1991). Nhung cay thuoc va vi thuoc Viet Nam (Glossary of Vietnamese Medicinal Plants and Drugs).

Chi, V. V. (2005). Cây rau, trái đậu dùng để ăn và trị bệnh.

Raina, K.; Kumar, D.; Agarwal, R. Promise of bitter melon (Momordica charantia) bioactives in cancer prevention and therapy. Semin. Cancer Biol. 2016, 40–41, 116–129.

Fang, E.F.; Froetscher, L.; Scheibye-Knudsen, M.; Bohr, V.A.; Wong, J.H.; Ng, T.B. Emerging Antitumor Activities of the Bitter Melon (Momordica charantia). Curr. Protein ,Pept. Sci. 2019, 20, 296–301.

Nerurkar, P.; Ray, R.B. Bitter melon: Antagonist to cancer. Pharm. Res. 2010,27, 1049– 1053.

Farooqi, A.A.; Khalid, S.; Tahir, F.; Sabitaliyevich, U.Y.; Yaylim, I.; Attar, R.; Xu, B. Bitter gourd (Momordica charantia) as a rich source of bioactive components to combat cancer naturally: Are we on the right track to fully unlock its potential as inhibitor of deregulated signaling pathways. Food Chem. Toxicol. 2018, 119, 98– 105

Dunwell, J. M. (1996). Microspore culture. In In vitro haploid production in higher plants(pp. 205-216). Springer, Dordrecht.

Kumar, O., & Choudhary, M. (2020). Double Haploid: An overview. International Journal of Current Microbiology and Applied Science,9(1), 1012-1029.

Nguyên, H. T. C., & Nhã, N. T. (2019). Nghiên cứu nuôi cấy in vitro noãn và bao phấn ớt (Capsicum sp.) phục vụ tạo dòng đơn bội kép. Journal of Science and Technology,2(4), 31-37.

Thanh Hải, N., & Thị Thanh Tâm, Đ. (2017). Tạo cây cải đông dư (Brassica juncea) đơn bộiin vitrobằng nuôi cấy bao phấn.Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, (5), 739.

Maluszynski, M., Kasha, K., Forster, B. P., & Szarejko, I. (Eds.). (2003). Doubled haploid production in crop plants: a manual. Springer Science & Business Media. Maraschin, S. D. F., De Priester, W., Spaink, H. P., & Wang, M. (2005). Androgenic

switch: an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective.Journal of Experimental botany,56(417), 1711-1726.

Germana, M. A. (2011). Anther culture for haploid and doubled haploid production.Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC),104(3), 283-300. Rao, P. S., & Suprasanna, P. (1996). Methods to double haploid chromosome numbers.

InIn vitro haploid production in higher plants(pp. 317-339). Springer, Dordrecht. Reed, S. M. (2018). Production of haploid tobacco plants using anther culture. Plant

Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises, 291.

Pechan, P. M. and Smykal, P. (2001) ‘Minireview Androgenesis : Affecting the fate of the male gametophyte’,Physiologia Plantarum, 111, pp. 1–8.

Babbar, S. B., Agarwal, P. K., Sahay, S., & Bhojwani, S. S. (2004). Isolated microspore culture of Brassica: an experimental tool for developmental studies and crop improvement.

Ferrie, A. M. R., Epp, D. J., & Keller, W. A. (1995). Evaluation of Brassica rapa L. genotypes for microspore culture response and identification of a highly embryogenic line.Plant cell reports,14(9), 580-584.

Ahmad, N., Hasan, N., Ahmad, Z., Zishan, M., & Zohrameena, S. (2016). Momordica charantia: for traditional uses and pharmacological actions. Journal of Drug Delivery and Therapeutics,6(2), 40-44.

Anitasari, S. D., Astarini, I. A., Defiani, M. R., Pharmawati, M., & Prayantini, D. C. (2019). Pollen Viability and Microspore Culture in Three Broccoli Cultivars (Brassica oleracea L. var. italica Plenck).Jurnal Biota,5(2), 118-127.

Raina, S. K. and Irfan, S. T. (1998) ‘High-frequency embryogenesis and plantlet regeneration from isolated microspores of indica rice’, pp. 957–962.

Rivas-sendra, P. S. A. and Jose, J. P. (2012) ‘Influence of the stage for anther excision and heterostyly in embryogenesis induction from eggplant anther cultures’, pp. 235–250.

Han, N., Kim, S. U., Park, H. Y., & Na, H. (2014). Microspore-derived embryo formation and morphological changes during the isolated microspore culture of radish (Raphanus sativus L.).Horticultural Science & Technology,32(3), 382-389. Seo, M.; Sohn, S.; Park, B.; Ko, H.; Jin, M. Efficiency of microspore embryogenesis in Brassica rapa using different genotypes and culture conditions. J. Plant Biotechnol.2014,41, 116–122.

Abraha, E., Bechyne, M., Klima, M., & Vyvadilova, M. (2008). Analysis of factors affecting embryogenesis in microspore cultures of Brassica carinata. Agricultura Tropica et Subtropica,41(2), 53-59.

Preharvest, M. et al. (2015) ‘Biologically Active Compounds in Melon: Modulation by Preharvest, Post-harvest, and Processing Factors’, in Processing and Impact on Active Components in Food. Elsevier Inc., pp. 165–171

Usman, M., Bakhsh, K., Fatima, B., Zaman, Q., & Shah, M. H. (2015). Exploring embryogenic competence in anthers of Bitter gourd (Momordica charantia L.) cultivar Faisalabad long.The Journal of Animal & Plant Sciences,25(1), 181-188. Wędzony, M., Forster, B. P., Żur, I., Golemiec, E., Szechyńska-Hebda, M., Dubas, E., &

Gołębiowska, G. (2009). Progress in doubled haploid technology in higher plants.Advances in haploid production in higher plants, 1-33.

Pechan, P. M. L. et al. (1991) ‘Messenger-RNA and protein changes associated with induction of Brassica microspore embryogenesis’,Planta, 184, pp. 161–165. Hafizur, R. M., Kabir, N., & Chishti, S. (2011). Modulation of pancreatic β-cells in

neonatally streptozotocin-induced type 2 diabetic rats by the ethanolic extract of Momordica charantia fruit pulp. Natural Product Research, 25(4), 353-367.

Nitsch, C. (1967). Induction" in vitro" de la floraison chez une plante de jours courts, Plumbago indica" L. Université, Faculté des Sciences.

Song, X. Y., Blackmore, S., Bera, S., & Li, C. S. (2007). Pollen analysis of spider webs from Yunnan, China.Review of Palaeobotany and Palynology,145(3-4), 325- 333.

Salas, P. et al. (2012) ‘Influence of the stage for anther excision and heterostyly in embryogenesis induction from eggplant anther cultures’, Euphytica, 184(2), pp. 235–250. doi: 10.1007/s10681-011-0569-9.

Poolperm, S., & Jiraungkoorskul, W. (2017). An update review on the anthelmintic activity of bitter gourd, Momordica charantia.Pharmacognosy reviews,11(21), 31. Zhan, Y., Chen, J., & Malik, A. A. (2009). Embryoid induction and plant regeneration of cucumber (Cucumis sativus L.) through microspore culture. Acta Horticulturae Sinica,36(2), 221-226.

Shumilina, D., Kornyukhin, D., Domblides, E., Soldatenko, A., & Artemyeva, A. (2020). Effects of Genotype and Culture Conditions on Microspore Embryogenesis and Plant Regeneration in Brassica Rapa ssp. Rapa L. Plants, 9(2), 278.

Tuncer, B. (2017). Callus formation from isolated microspore culture in radish (Raphanus sativus L.). J. Anim. Plant Sci, 27(1), 277-282.

PHỤ LỤC

BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN MURASHIGE – SKOOG (MS, 1962)

Stock Hóa chất Thành phần cơ bản

(mg/L) Dung tích dùng cho 1 lít môi trường MS1 KNO3 1900 20 ml KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 MS2 CaCl2.2H2O 440 10 ml MS3 H3BO3 6,2 10 ml MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4. 5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 MS4 FeSO4.7H2O 27,8 10 ml Na2-EDTA 37,3 MS5 Glycine 2 10 ml Myo-Inositol 100 Thiamine HCl 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5

GAMBORG (1968) Stock Ingredients mg/l Stock 1 (NH4)2SO4 134 KNO3 2500 CaCl2.2H2O 150 NaH2PO4.H2O 150 Stock 2 H3PO3 3 MnSO4.2H2O 10 ZnSO4.7H2O 2 KI 2.5 NaMoO4 0.3 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Stock 3 MgSO4.7H2O 250 Stock 4 FeSO4.7H2O 30 NaEDTA 36 Stock 5 Thiamine HCl 10 Nicotinic acid 1 Prydoxine HCl 1

NLN13(1986)

Ingredients Stock preparation Final

concentration (mg/L) Stock No. (strength) Amount (mg or g) Total volume (ml) Stored aliquots (ml) Macroelements 1(20x) g 1,000 50 KNO3 2.5 125 Ca(NO3)2 10 500 MgSO4 2.5 125 KH2SO4 2.5 125 Micro elememts 2(200x) (mg) 250 100 MnSO4.4H2O 0,125 25 ZnSO4.7H2O 500 10 H3BO3 500 10 Na2MoO4.2H2O 12,5 0.25 CuSO4.5H2O 1.25xx 0.025 CoCl2.6H2O 1.25xx 0.025 Iron source (g) 250 5 NaFe(III)EDTA 3(200x) 2 40 Organic component I (mg) 100 1 Nicotinic acid 4(1000x) 500 5 Thiamin HCl 50 0.5 Prydoxine HCl 50 0.5 Folic acid 50 0.5 Biotin 0,5g 0.05 Glycine 200 2 Organic component II (g) 500 20 L- Serine 5(50x) 2.5 100

L-Glutamine 20 800

Glutamine 0.75 30

Myo-inositol 2.5 100

Carbonhydrate