CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.7. Xây dựng cây phát sinh loài
Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh trên ngân hàng gene NCBI để định danh loài. Sau đó xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X. Các trình tự DNA đƣợc kiểm tra và đƣợc xác nhận với công cụ BLAST. Các trình tự gene của chủng vi khuẩn tuyển chọn đƣợc sắp xếp (Alignment) bằng phần mềm MUSCLE. Tất cả trình tự đƣợc lƣu trữ trên ngân hàng dữ liệu với các mã số truy cập. Mức độ tƣơng đồng của trình tự nucleotide, acid amin và khoảng cách di truyền (p – distance) giữa các loài đƣợc tính toán thống kê bằng MEGA X. Việc xác định mô hình thay thế nucleotid phù hợp nhất đƣợc tính toán bằng Modeltest trong MEGA X. Mô hình có giá trị theo BIC (Bayesian Information Criterion) sẽ đƣợc lựa chọn để xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa các loài. Các vị trí codon bao gồm 1st + 2nd + 3rd. Cây quan hệ phát sinh đƣợc xây dựng trên hai phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML). Cây phát sinh ML đƣợc xây dựng theo mô hình GTR+G+I, phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (resampling), bằng phần mềm MEGA X. Từ đó, đƣa ra những kết luận về mã vạch phân tử để định loài.
2.2.8. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn định danh được
Với mục tiêu xác định đƣợc khả năng sử dụng các chủng vi khuẩn Rhodobacter
sp. đƣợc định danh đến loài trong mục 2.2.6. trong các ứng dụng thực tế, tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của chúng bằng việc khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng (pH, độ mặn) đến quá trình sinh trƣởng.
a. pH
Chuẩn bị môi trƣờng tăng sinh DSMZ-27, chủng đƣợc lựa chọn nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 100ml/L, khảo sát ở dãy pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện chiếu sáng và ghi nhận kết quả sau 7 ngày. Xác định khoảng pH mà tại đó chỉ số CFU đạt giá trị cao nhất (số lƣợng vi sinh vật nhiều nhất) thì đó là khoảng pH tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật.
b. Ảnh hƣởng của nồng độ muối
Chuẩn bị môi trƣờng DSMZ-27, chủng đƣợc lựa chọn đƣợc nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 300ml, khảo sát nồng độ muối ở dãy 0‰; 10‰; 15‰; 20‰; 25‰; 30‰; 35‰ và pH đƣợc đã đƣợc chọn ở mục a. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện chiếu sáng và ghi nhận kết quả sau 7 ngày.
21
2.2.9. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng VKTQH định danh được
Xây dựng đƣờng tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào log (CFU/ ml)
Dịch canh nuôi cấy 7 ngày đƣợc pha loãng trong môi trƣờng DSZM – 27 để đạt đƣợc nồng độ OD660nm lần lƣợt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6. Sau đó tiến hành pha loãng đến 10-8 và cấy trang lên đĩa môi trƣờng thạch DSMZ – 27 ở nồng độ 10-6; 10-7; 10-8.
Hình 2.4. Mối tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào R.capsulatus
Dựng đƣờng cong sinh trƣởng: Tiến hành đo giá trị OD 12 giờ/ lần từ canh trƣờng nuôi cấy bằng máy đo quang phổ Jasco V750. Dựa vào kết quả giá trị OD và phƣơng trình tƣơng quan để dựng đƣờng cong sinh trƣởng.
Tính tốc độ tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
- Xt: mật độ tế bào ở thời điểm t - X0: mật độ tế bào tại thời điểm t0 - t0: thời điểm ban đầu (0 giờ).
2.2.10. Phương pháp đánh giá hiệu quả xử lý chất hữu cơ của chủng VKTQH định danh được
Thí nghiệm đƣợc sử dụng 30 bình trụ có thể tích 300ml, cho vào mỗi bình 2% dung dịch vi khuẩn thu đƣợc từ mục 2.2.6 với pH và độ mặn đƣợc xác định ở mục
y = 3.1169x + 8.2563 R² = 0.9965 8 8.5 9 9.5 10 10.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 M ật độ tế b ào ( Log CFU/m l) OD 𝐥𝐧 𝑿𝒕 − 𝐥𝐧 𝑿𝟎 𝒕 − 𝒕𝟎
22
2.2.8, bổ sung hàm lƣợng chất hữu cơ lần lƣợt là: 10, 50, 100, 200, 400mgC/L. Tạo môi trƣờng nƣớc thải giả định bằng cách bổ sung glucose để có nồng độ hữu cơ lần lƣợt là 10, 50, 100, 200, 400mgC/L.
Thí nghiệm đối chứng: môi trƣờng có độ mặn và pH đƣợc xác định ở mục 2.2.8 với hàm hàm lƣợng chất hữu cơ lần lƣợt là: 10, 50, 100, 200, 400mgC/L nhƣng không bổ sung VKTQH Rhodobacter.
Mật độ VKTQH Rhodobacter đƣợc xác định thông qua độ hấp thụ dịch huyền phù tế bào trên máy quang phổ. Hàm lƣợng chất hữu cơ đƣợc theo dõi mỗi ngày thông qua chỉ tiêu COD bằng phƣơng pháp permanganate (QCVN6186-1996, n.d.).
2.2.11. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần. Kết quả đƣợc tính toán và xử lý bằng toán thống kê trên chƣơng trình MS – excel và Rstudio
23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩn Rhodobacter sp. từ mẫu nƣớc thải ao nuôi tôm
Từ các mẫu nƣớc thu nhận ở khu vực thôn Trƣờng Định, xã Hoà Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng và tại thôn Hiệp Hƣng, xã Bình Hải, huyện Thăng Bình, tỉnh Quảng Nam, đã phân lập đƣợc 4 chủng vi khuẩn kí hiệu (RH01→ RH04) có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng DSMZ - 27 lỏng.
Quan sát các bình chứa môi trƣờng DSMZ – 27 sau 7 ngày nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, nhận thấy có sự xuất hiện các vạch màu từ nâu vàng đến đỏ tía xuất hiện trên thành bình (là biểu hiện sự có mặt sắc tố đặc trƣng của VKTQH). Kết quả quan sát chứng minh đƣợc trong bình môi trƣờng có sự sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn Rhodobacter sp. Điều này phù hợp với một số nghiên cứu về
Rhodobacter sp. đều khẳng định rằng vi khuẩn này khi phát triển sẽ có các màu nâu vàng đến đỏ tía trên thành bình (Hunter et al., 2009).
Từ các vạch màu trên thành bình, tiến hành lấy mẫu và phân lập trên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch DSMZ – 27 cho đến khi thuần chủng và quan sát màu sắc khuẩn lạc. Hình ảnh khuẩn lạc đƣợc mô tả ở hình 3.1 và bảng 3.1.
Đặc điểm về hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải đƣợc mô tả ở hình 3.1 và bảng 3.1
24
Bảng 3.1.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng VK phân lập đƣợc
STT Tên kí hiệu Đặc tính khuẩn lạc Màu sắc Đặc điểm Đƣờng kính Vị trí phân lập 1 RH01 Hồng đậm Tròn, rìa ngoài, ƣớt, bề mặt lồi, nhầy 3.3µm thôn Trƣờng Định – Đà Nẵng 2 RH02 Hồng nhạt Tròn, bề mặt lồi, bóng 3.1 µm thôn Hiệp Hƣng, huyện Thăng Bình, tỉnh Quảng Nam 3 RH03 Hồng nhạt Tròn, bề mặt lồi, rìa phẳng 2.6µm thôn Hiệp Hƣng, huyện Thăng Bình, tỉnh Quảng Nam 4 RH04 Nâu vàng Tròn, bề mặt phẳng, rìa trong 1.9µm thôn Hiệp Hƣng, huyện Thăng Bình, tỉnh Quảng Nam Đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của 4 dòng vi khuẩn là 2.7µm
Kết quả nghiên cứu ở hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy, các chủng VK phân lập đƣợc có khuẩn lạc dạng tròn, bề mặt lồi; một số có nhầy, bóng với rìa phẳng, có các màu sắc chủ yếu là hồng nhƣ: hồng đầm (RH01), hồng nhạt (RH02, RH03), nâu vàng (RH04). Đƣờng kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn biến thiên trong khoảng 1.9µm – 3.3µm, với đƣờng kính trung bình là 2.7µm.
Vì sử dụng môi trƣờng phân lập đặc trƣng và các chủng vi khuẩn có sắc tố hồng, và nâu vàng nên nhận định 4 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có xác suất cao là thuộc chi Rhodobacter sp. (Hunter et al., 2009). Nhằm khẳng định điều này, chúng tôi tiến hành định danh đến tên chi của 4 chủng vi khuẩn, sử dụng phối hợp phƣơng pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi, thử nghiệm catalase, gelatin, urea, citrate.
25
3.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc lập đƣợc
a) Xác định Gram
Quan sát dƣới kính hiển vi ở vật kính 100 cho thấy 4 chủng vi khuẩn (RH01→ RH04) bắt màu hồng khi nhuộm Gram. Điều này chứng tỏ 4 chủng vi khuẩn này thuộc nhóm gram âm (hình 3.2). Vi khuẩn Gram âm ngoài lớp màng bao bọc tế bào chất ra còn có thêm một lớp màng ngoài khác đƣợc cấu tạo bởi phospholipid và lipopolysaccharide. Màng ngoài có chức năng nhƣ một cái lọc để chặn lại những phân tử có kích thƣớc lớn từ 600 đến 1000 Da. Màng ngoài còn có tính chọn lọc rất cao đối với các các hợp chất kỵ nƣớc do trên màng có các phân tử các lipophilic (Döbereiner et al., 1995). Đặc tính về hình thái tế bào dƣới kính hiển vi đƣợc miêu tả trong bảng 3.2
Bảng 3.2.Đặc tính hình thái của 04 dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
Tên kí hiệu Đặc tính hình thái Nguồn phân lập Hình ảnh Đặc điểm RH01 thôn Trƣờng Định – Đà Nẵng Hình trứng. RH02 thôn Hiệp Hƣng, huyện Thăng Bình, tỉnh Quảng Nam Hình cầu,tạo thành chuỗi
26
RH03 Nt Hình trứng.
RH04 Nt Hình trứng.
Từ kết quả mô tả ở bảng 3.2 ghi nhận thấy, tế bào của 4 chủng vi khuẩn này có dạng hình cầu, trứng, nằm riêng rẽ nhau hoặc tạo thành chuỗi.
b) Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng
Hình 3.2..Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng của 4 chủng vi khuẩn (A: Glucose, B: Mantose, C: Fructose)
Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng đối với 4 chủng vi khuẩn RH01, RH02, RH03, RH04 kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng vi khuẩn RH02 cho kết quả dƣơng tính đối với tất cả các thử nghiệm. Các chủng còn lại cho kết quả âm tính.
c) Thử nghiệm Catalaste
Thử nghiệm catalaste đối với 4 chủng vi khuẩn RH01, RH02, RH03, RH04 kết quả thí nghiệm cho thấy, 3 chủng vi khuẩn RH01, RH02, RH04 cho kết quả dƣơng
27
tính (có hiện tƣợng sủi bọt khi nhỏ H2O2 3% lên khuẩn lạc vi khuẩn) và 1 chủng RH03 còn lại cho kết quả âm tính (không có hiện tƣợng sủi bọt khí).
Hình 3.3..Kết quả thử nghiệm catalaste của 4 chủng vi khuẩn
d) Thử nghiệm phân giả Urea – (NH)2CO
Thử nghiệm Urea đối với 4 chủng vi khuẩn RH01, RH02, RH03, RH04 kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng RH03 và RH04 cho kết quả dƣơng tính (MT chuyển sang màu hồng cánh sen). 2 chủng còn lại cho kết quả âm tính (MT không đổi màu).
Hình 3.4.. Thử nghiệm Citrat
Thử nghiệm Citrat đối với 4 chủng vi khuẩn RH01, RH02, RH03, RH04 kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng RH02 và RH04 cho kết quả dƣơng tính (MT chuyển sang màu xanh dƣơng). 2 chủng còn lại cho kết quả âm tính (MT không đổi màu).
Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm citrate của 4 chủng vi khuẩn
Từ các kết quả nghiên cứu trên đây, nhóm nghiên cứu đã tổng hợp đƣợc các đặc tính sinh hóa của 4 chủng vi khuẩn RH01 →RH04 (bảng 3.3).
28
Bảng 3.3. Tổng hợp các đặc tính sinh học của 4 chủng vi khuẩn RH01 →RH04
Tên RH01 RH02 RH03 RH04 Đặc điểm khuẩn lạc Màu sắc Hồng đậm Hồng nhạt Hồng nhạt Hồng nhạt Hình thái Tròn, ƣớt, bề mặt lồi, nhầy Tròn, bề mặt lồi, bóng Tròn, bề mặt lồi, rìa phẳng Tròn, bề mặt phẳng, rìa trong Đặc điểm tế bào Hình dạng Hình trứng Hình cầu Hình trứng Hình trứng Gram - - - - Đặc điểm sinh hóa Glucose - + - - Frutose - + - - Mantose - + - - Catalaste + - + + Urea - - + + Citrat - + - + Chú thích: (+)dƣơng tính (-) âm tính
Từ những kết quả thu nhận ở bảng 3.3 cho thấy, trong 4 chủng VK phân lập đƣợc thì chỉ có chủng RH02 có hình thái khuẩn lạc dạng tròn, bề mặt lồi, bóng, tế bào có hình cầu, tạo thành chuỗi, có phản ứng dƣơng tính với các loại đƣờng, citrate, urea âm tính với catalaste và là vi khuẩn Gram (-), phù hợp với các đặc điểm mô tả của vi khuẩn Rhodobacter sp. theo khóa phân loại của Bergey và những nghiên cứu của các nhà khoa học khác về vi khuẩn này (Bergey’s, 1989; Brenner et al., 2005; Weaver et al., 1975).
Với mục đích để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn thuộc chi Rhodobacter đồng thời xác định tên loài của chúng, tiến hạnh định danh chủng đó bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
29
3.3. Định danh chủng vi khuẩn RH02 bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sau khi đƣợc phân lập và tuyển chọn, chủng vi khuẩn RH02 định danh sơ bộ thuộc chi Rhodobacter. Nhằm định danh chúng đến tên loài, chọn phƣơng pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm tách chiết, tinh sạch DNA tổng sổ, khuếch đại vùng gen và sản phẩm PCR đƣợc gửi tại công ty Apical Scientific Sequencing Malaysia để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA. Kết quả đọc trình tự 16s – rRNA đƣợc so sánh trên ngân hàng gen NCBI để định danh loài RH02.
3.3.1. Tách chiết và khuếch đại gen
Sinh khối chủng RH02 đƣợc thu sau 7 ngày nuôi cấy để tách chiết DNA tổng số. Kết quả tách chiết DNA tổng số của chủng RH02 thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn RH02
(M là DNA ladder 3000 bp (Cleaver), RH02 DNA tổng số của mẫu RH02)
3.3.2. Phân tích gel sản phẩm PCR
DNA tổng số của mẫu chủng vi khuẩn RH02 sau khi tách thành công đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR điện di trên gel cho kết quả nhƣ sau:
Giếng 1 (mẫu RH02) xuất hiện 1 băng duy nhất kích thƣớc 1500bp.
30
3.3.3. Giải trình tự đoạn gen 16S – rRNA và định danh loài
Hình 3.8. Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng chủng vi khuẩn Rhodobacter
Chủng vi khuẩn RH02 có trình tự vùng gen 16s – rRNA tƣơng đồng 97.70% với loài Rhodobacter capsulatus (hình 3.8). Cho phép kết luận chủng vi khuẩn RH02 là loài Rhodobacter capsulatus.
Nhƣ vậy, qua bƣớc định danh ở cấp độ loài, xác định đƣợc chủng vi khuẩn RH02 là loài vi khuẩn Rhodobacter capsulatus. Do đó, trong những bƣớc tiếp theo, tiến hành nghiên cứu trên đối tƣợng này.
31
3.3.4. Cây phát sinh loài
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loài của chủng VKTQH chọn lựa dựa trên trình tự
nucleotide gen 16S-rDNA
Từ cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng RH02 cùng nằm trên một nhánh với các loài thuộc chi Rhodobacer và có tỷ lệ tƣơng đồng cao nhất với loài
Rhodobacter capsulatus (có độ tƣơng đồng là 99%). Có mã số đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế là KF054927 và DQ001154.
32
3.4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn Rhodobacter capsulatus khuẩn Rhodobacter capsulatus
3.3.1. Ảnh hưởng của pH
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng et al., 2005). Đăc biệt ở chủng vi khuẩn
R.capsulatus, pH còn ảnh hƣởng đến hình thái của tế bào. Để xác định ảnh hƣởng của yếu tố này đến chủng vi khuẩn đã lựa chọn tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng DSMZ -27 lỏng, khảo sát ở dãy pH, 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Kết quả đƣợc thể hiện hình 3.10 và 3.11.
Hình 3.10.Tốc độ sinh trƣởng của R. capsulatus trong điệu kiện chiếu sáng
33
Kết quả nghiên cứu ở hình 3.10 và 3.11 cho thấy, chủng vi khuẩn có thể sinh trƣởng khá tốt trong khoảng pH 6-7.5 ở cả 2 điều kiện chiếu sáng và che tối. Bên cạnh đó trong điều kiện pH nhỏ hơn 5 vi sinh vật bị ức chế và có tốc độ sinh trƣởng cực chậm và trong điều kiện chiếu sáng cho kết quả khả quan hơn so với ở điều kiện che tối. Kết quả thí nghiệm phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc (Brenner et al., 2005; Đỗ Thị Liên, 2016).
Trong điều kiện chiếu sáng vi khuẩn R. capsulatus cho tốc độ sinh trƣởng nhanh hơn so với trong điều kiện cho tối, tốc độ sinh trƣởng đạt cực đại ở mức 0.08 với mật độ tế bào 15x108 CFU/ml, ở điều kiện cho tối tốc độ sinh trƣởng đạt cực đại chỉ ở mức 0.05 với mật độ tế bào 12x108 CFU/ml. Vi khuẩn R. capsulatus là VKTQH có thể tiến hành quá trình quang hợp để thu và nhận năng lƣợng nhằm phục vụ cho các hoạt động sống của tế bào (CA, 1982). Do đó trong điều kiện chiếu sáng cho tốc độ sinh trƣởng và phát triển nhanh hơn ở điều kiện che tối.
Nhƣ vậy chủng vi khuẩn R. capsulatus phân lập đƣợc có khả năng sinh trƣởng