Bảng 2 .2 Diện tíc h3 loại rừng của cả nước và các tỉnh NC ở Lào
Bảng 2.6 Các chỉ tiêu hình thái các lồi tắc kè
STT Kí hiệu Giải thích
Phần các chỉ số đo (mm)
1 SVL Chiều dài thân hoặc kích thước
2 TaL Chiều dài của đuôi
3 AG Khoảng cách từ chi trước đến chi sau
4 HL Chiều dài của đầu
5 HW Chiều rộng của đầu
6 HH Chiều cao của đầu
7 SE Khoảng cách mút mõm đến hốc trước mắt
8 EyeEar Khoảng cách mắt và tai
9 ForeL Chiều dài của chi trước
10 FemurL Chiều dài của đùi
11 CrusL Chiều dài của ống chân
12 LD4A Chiều dài của ngón tay thứ 4
13 LD4P Chiều dài của ngón chân thứ 4
14 OD Đường kính của mắt
15 EarL Chiều rộng của tai
16 RW Chiều rộng của tấm mõm
17 RH Chiều cao của tấm mõm
18 MW Chiều rộng của tấm cằm
19 ML Chiều dài của tấm cằm
Phần các chỉ số đếm (1, 2, 3, ...)
20 CS Số gai ở mi mắt
21 N Vảy bao quanh mũi
22 I Tấm giữa tấm trên mũi
23 SL Số vảy môi trên
24 IL Số vảy mơi dưới
Mẫu vật sau khi đã phân tích các số liệu hình thái được định tên khoa học theo các tài liệu Smith (1935), Taylor (1963), Đào Văn Tiến (1979),
Nguyen et al. (2010, 2011), Hartmann et al. (2013), Ziegler et al. (2013, 2016), Nguyen et al. (2014), Luu et al. (2014, 2015, 2016), Vassilieva et al. (2016), Schneider et al. (2020) và các tài liệu khác có liên quan.
Ngồi ra, sau khi phân tích định loại mẫu dựa trên các tài liệu, còn so sánh mẫu vật thu được với các mẫu vật đã được định tên đang lưu giữ ở Trường Đại học Lâm nghiệp, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, Việt Nam.
Danh lục và tên khoa học của các loài tắc kè được sắp xếp theo Uetz et al. (2021). Tên phổ thông của các bậc phân loại theo Nguyen et al. (2009) và một số tài liệu mới cơng bố gần đây.
STT Kí hiệu Giải thích
26 PO Số hàng vảy từ mũi đến mắt
27 PM Số tấm cằm
28 GP Số vảy bao quanh tấm cằm
29 DTR Số hàng củ lồi trên thân
30 GSDT Số vảy bao quanh củ lồi
31 SBL Số vảy từ sau tấm cằm đến lỗ huyệt
32 SR Số hàng vảy bao quanh thân
33 V Số hàng vảy bụng
34 LF1 Số vảy ngang trên ngón tay 1
35 LF4 Số vảy ngang trên ngón tay 4
36 LT1 Số vảy ngang trên ngón chân 1
37 LT4 Số vảy ngang trên ngón chân 4
38 PP Số vảy lỗ ở đường trên lỗ huyệt
Hình 2.3. Các chỉ tiêu đo và đếm mẫu vật tắc kè
2.3.5. Tách chiết DNA và giải trình tự
Các mẫu mơ được lưu trữ ở 4oC trước khi tiến hành tách chiết. Phần mơ dùng cho q trình tách chiết được lấy ở phần sâu bên trong khối mẫu vật nhằm hạn chế nguy cơ nhiễm. Bộ Kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, CHLB Đức) được sử dụng cho các mẫu có dung lượng ít hoặc thu từ lâu và bảo quản trong điều kiện nhiệt độ và dung dịch không đảm bảo và GeneJet Genomic DNA Purification (ThermoFisher Scientific, Lithuania) cho các mẫu mô mới thu, lượng mẫu nhiều và bảo quản trong điều kiện đảm bảo (cồn Merck 70%, CHLB Đức). Quá trình tách chiết được tiến hành dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất, có chỉnh lý dựa trên quy trình. Quy trình tách chiết được thực hiện theo các bước cụ thể như sau tiền xử lý mẫu (cắt mẫu thành các mảnh nhỏ, để khô rồi
cho vào ống eppendoft 1.5 ml); phá màng tế bào và loại bỏ protein (sử dụng dung dịch đệm ATL, AL-Qiagen, CHLB Đức; Digestion Solution, Lysis solution-ThermoFisher Scientific, Lithuania và protein K-Qiagen, CHLB Đức); kết tủa DNA (sử dụng cồn 100% hoặc 50%-Merk, CHLB Đức); tách DNA khỏi các thành phần khác của tế bào (cột lọc có chứa màng silica); làm sạch DNA (sử dụng các dung dịch đệm AW1, AW2-Qiagen, CHLB Đức; Wash 1, Wash 2-ThermoFisher, Lithuania), hòa tan DNA (dung dịch đệm AE-
Qiagen, CHLB Đức; Elution Buffer-ThermoFisher Scientific, Lithuania). Sau khi tách chiết DNA tổng số, nồng độ ADN tổng số thu được được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, đệm TBE 1X (Tris base, Boric acid, EDTA pH 8) ở 70V trong vòng 30 phút. DNA tổng số được so sánh với marker 1 kb và sau đó được hiển thị bằng tia cực tím trên máy Alphamager MINI (Protein Simple, Mỹ).
Phản ứng PCR được thực hiện để khuếch đại đoạn gen COI thuộc hệ gen ty thể với cặp mồi. Trong nghiên cứu này là ưu tiên sử dụng mastermix thành phẩm nhằm bỏ qua thời gian tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR và tiết kiệm nguồn mẫu vốn ít ỏi để có thể tiến hành khuếch đại các đoạn gen khắc phục mở rộng nghiên cứu về tiến hóa trong tương lai. Hai mastermix thành phẩm được sử dụng trong nghiên cứu gồm HotStarTaq Mastermix với những mẫu có nồng độ DNA thấp và DreamTaq Mastermix dùng để khuếch đại những mẫu có nồng độ DNA cao.
Tổng thể tích của mỗi phản ứng PCR là 21 µl, bao gồm 1-2 µl ADN khn (tùy theo nồng độ DNA tách chiết thu được), 2 µl mỗi mồi (10 µM/µl), 5 µl nước, 10 µl mastermix. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR là 95oC ở 15’ đối với mastermix của Qiagen và 5’ đối với mastermix của ThermoFisher; 35 chu kỳ phản ứng ở 95oC trong 30’’, 48oC-60oC trong 45’’, 72oC trong 1’; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 6’. Đối chứng âm được tiến hành song song trong mỗi lần tách chiết cũng như trong mỗi lần PCR.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, 2pg/ml ethidium-bromide, trong đệm TBE 1X (Tris base, Boric acid, EDTA pH 8) ở 90 V trong 30 phút. Sau đó được hiển thị bằng tia cực tím trên máy Alphamager MINI (Protein Simple, Mỹ). Các sản phẩm PCR thành công được tinh sạch sử dụng kit GeneJET PCR Purification (ThermoFisher
Scientific, Lithuania). Qui trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bao gồm các bước gắn DNA lên màng (sử dụng dung dịch đệm Binding Buffer và cột lọc chứa màng silica); làm sạch DNA (sử dụng 350 µl dung dịch đệm Wash Buffer); hịa tan DNA (sử dụng 30 µl dung dịch đệm hịa tan Elution Buffer). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được bảo quản ở -4oC sau đó gửi giải trình tự hai chiều tại công ty FirstBase (Malaysia).
2.3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng phần mềm Sequencher v5.4.6 (Gene Codes Corp, AnnArbor, MI, USA). Trình tự thu nhận được, được kiểm tra sử dụng cơng cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) có trên trang web của tổ chức National Center for Biotechnology Information. Sau đó, các trình tự đã được giải cùng với các trình tự từ Ngân hàng Gen (Genbank). Sau khi các trình tự được căn chỉnh bằng cách sử dụng phần mềm Clustal X v2 (Thompson et al. 1997), dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng phân tích cú pháp tối đa (MP) như được triển khai trong PAUP*4.0b10 (Swofford 2001), khả năng xảy ra tối đa (ML) như được triển khai trong IQ-TREE v1.6.7.1 (Nguyen et al. 2015), và Bayesian Inference (BI) như được triển khai trong MrBayes v3.2.7 (Ronquist et al. 2012).
Các cài đặt cho phân tích MP và BI theo Le et al. (2006), ngoại trừ việc số thế hệ trong phân tích Bayes đã tăng lên 1×107. Cả BI và ML đều được chạy bằng một mơ hình tốt nhất, TVM+I+G, như được chọn bởi jModelTest v2.1.4 (Posada 2008). Điểm giới hạn cho chức năng ghi được đặt là 54 trong phân tích Bayes, vì điểm -lnL đạt mức ổn định sau 54.000 thế hệ trong cả hai lần chạy.
Hỗ trợ Nodal được đánh giá bằng cách sử dụng 1.000 bản sao bootstrap (BP) như được tính tốn trong PAUP, 10.000 bản sao bootstrap siêu nhanh (UFB) trong IQ-TREE v1.6.7.1 và xác suất sau (PP) trong MrBayes v3.2. BP ≥ 70 và PP, UFBP ≥ 95% được coi là hỗ trợ mạnh mẽ cho một nhánh (Hillis & Bull 1993; Ronquist et al. 2012; Nguyen et al. 2015) Sự phân kỳ theo cặp khơng hiệu chỉnh được tính tốn trong PAUP* 4.0b10.
2.3.7. Phân tích thống kê
Sử dụng phần mềm MS-Excel trong Microsoft Office 2010 và dựa trên số liệu thu thập được trong quá trình thực địa, kết hợp tham khảo các cơng trình đã cơng bố, nghiên cứu này so sánh mức độ tương đồng về thành phần loài giữa miền Bắc và miền Trung các tỉnh có sinh cảnh tương tự. So sánh tương quan giữa thành phần loài giữa các khu vực đã sử dụng phần mềm PAST Statistic Hammer et al. (2001) để phân tích thống kê.
Số liệu được mã hố theo dạng đối xứng (1 Có mặt; 0 Khơng có mặt). Chỉ số tương đồng (Sorensen-Dice index) được tính như sau
djk = 2M/(2M+N)
Trong đó M là số lồi ghi nhận cả 2 vùng; N là tổng số loài chỉ ghi nhận ở một vùng.
2.3.8. Đặc điểm phân bố của các loài tắc kè1). Phân bố theo sinh cảnh 1). Phân bố theo sinh cảnh
Căn cứ vào phân chia dạng thảm thực vật và mức độ tác động của con người đếm thảm thực vật theo tài liệu “Sổ tay hướng dẫn điều tra và giám sát đa dạng sinh học (2003) và căn cứ hiện trạng rừng núi đá vôi tại KVNC, được đánh giá phân bố của các loài tắc kè ở 3 dạng sinh cảnh chính gồm
- Sinh cảnh núi đá vôi thuộc khu canh tác (SC1) là khu vực người dân sử dụng đất trồng các loại cây nông nghiệp và cơng nghiệp hoặc các loại theo mùa trong đó có các dãy núi đá vơi xen kẽ ở khu đó (hình 2.4).
- Sinh cảnh núi đá vơi thuộc rừng thứ sinh (SC2) là khu vực rừng đã bị tác động hoặc rừng khơng phát triển, ít cây gỗ to dạng rừng nghèo trong đó có phân bố của núi đá vơi (hình 2.4).
- Sinh cảnh núi đá vơi thuộc rừng nguyên sinh (SC3) là khu vực rừng giầu ít bị tác động có nhiều cây gỗ lớn (hình 2.4).
Hình 2.4. Các dạng sinh cảnh A (SC1); B (SC2); C (SC3)
2). Phân bố theo đai độ cao
Bain & Hurley (2011) căn cứ vào điều kiện tự nhiên gồm địa hình và thảm thực vật đã phân chia khu vực Đông Dương thành 02 đai độ cao là dưới 800 m và trên 800 m. Về nguyên tắc vẫn tuân thủ theo phương pháp phân chia như trên và vẫn tổng hợp số liệu để so sánh.
Tuy nhiên do căn cứ vào đặc điểm thực tế của KVNC có các dạng sinh cảnh phân bố ở nhiều đai độ cao, địa hình có cả đồng bằng và đồi núi từ miền Trung đến miền Bắc và mức độ tác động của con người cũng tương đối giống nhau. Vì vậy để làm rõ và chi tiết hơn độ cao được chia theo mỗi mức là 200 m như độ cao dưới 200 m, từ 200 đến dưới 400 m, từ 400 đến dưới 600 m, từ 600 đến dưới 800 m, từ 800 đến dưới 1.000 m và trên 1.000 m.
3). Ghi nhận về nơi cư trú của các loài tắc kè
Để đánh giá nơi cư trú của các loài trong họ Tắc kè (Gekkonidae), căn cứ vào vị trí bắt gặp được phân ra thành 3 vị trí gồm
- Trên cây là tất cả các vị trí của của các lồi cây như thân cây, cành hoặc các dây leo... (hình 2.5).
- Mặt đất là các khe lỗ, hốc, bề mặt đất hoặc các khe của chân núi đá, vách đá sát mặt đất (hình 2.5).
Hình 2.5. Các vị trí bắt gặp, A Vách đá; B Mặt đất; C Trên cây.
2.3.9. Đánh giá tình trạng bảo tồn
Việc đánh giá và xác định các mối đe dọa thông qua quan sát trực tiếp trên thực địa. Đánh giá các nhân tố có ảnh hưởng trực tiếp đến các loài tắc kè như Các Nhà máy nổ và dập đá, phá đốt rừng làm nương rẫy suy thoái sinh cảnh sống. Danh lục Đỏ của Hiệp hội Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN, 2021); Luật bảo vệ Động vật hoang dã số 07/QH Lào ngày 24/12/2007; Nghị định Chính phủ Lào số 08/CP/2021, Phụ lục CITES (2021). Xác định địa điểm cần ưu tiên bảo tồn với các lồi tắc kè thơng qua phương pháp cho điểm và chồng ghép các lớp đánh giá. Các tiêu chí đánh giá gồm có 5 tiêu chí như (1) có sự đa dạng về thành phần loài, (2) số loài quý, hiếm đang bị đe dọa, (3) chất lượng sinh cảnh, (4) mức độ tác động của con người, (5) mức độ được ưu tiên bảo vệ của khu vực. Phương pháp cho điểm của các tiêu chí dựa theo tài liệu Nguyễn Quảng Trường và cs. (2011). Thứ tự các điểm ưu tiên bảo tồn được tính bằng tổng điểm đánh giá với thang điểm từ 1-13. Điểm càng cao thì giá trị ưu tiên bảo tồn càng lớn.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đa dạng thành phần loài họ Tắc kè (Gekkonidae)
Trong nghiên cứu này, đã phân tích tổng số 138 mẫu vật (họ Tắc kè) thu được, 34 mẫu DNA và khoảng 800 bức ảnh chụp qua các đợt khảo sát thực địa. Các mẫu vật hiện đang lưu giữ tại phịng thí nghiệm Bộ mơn Động vật rừng, trường ĐHLN Việt Nam và Phòng lưu giữ mẫu vật khoa Lâm nghiêp, trường ĐHQG Lào.
Dựa trên cơ sở phân tích 138 mẫu vật thu được qua các đợt khảo sát thực địa, kết quả đã ghi nhận ở khu vực nghiên cứu có 28 lồi thuộc 6 giống, Trong đó, nhiều lồi nhất là giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus) với 9 lồi tiếp theo là giống Thằn lằn chân lá (Dixonius), giống Tắc kè (Gekko), giống Thạch sùng (Hemidactylus) và Thạch sùng dẹp (Hemiphyllodactylus) là đều có 4 lồi và giống Thạch sùng cụt (Gehyra) có 3 lồi (bảng 3.1).
Thành phần loài ở từng khu vực cụ thể như sau
Ở tỉnh Viêng Chăn ghi nhận 5 giống gồm 14 lồi, trong đó có 4 lồi nằm trong giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus), giống Thằn lằn chân lá (Dixonius) có 3 lồi, giống Thạch sùng (Hemidactylus) có 4 lồi, giống Thạch sùng cụt (Gehyra) có 2 lồi và giống Tắc kè (Gekko) có 1 lồi (bảng 3.1).
Ở tỉnh Luông Pha Bang ghi nhận 6 giống gồm 8 lồi, trong đó có 3 lồi giống Thạch sùng (Hemidactylus), 1 lồi giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus), 1 loài giống Thằn lằn chân lá (Dixonius), 1 loài giống Tắc kè (Gekko), 1 loài giống Thạch sùng cụt (Gehyra) và 1 loài giống Thạch sùng dẹp
(Hemiphyllodactylus) (bảng 3.1).
Ở tỉnh U Đôm Xay ghi nhận 4 giống gồm 5 lồi, trong đó 2 lồi giống Thạch sùng (Hemidactylus), 1 lồi giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus), 1 lồi giống Tắc kè (Gekko) và 1 loài Thạch sùng dẹp (Hemiphyllodactylus).
Ở tỉnh Xiêng Khoảng ghi nhận 3 giống gồm 3 lồi, trong đó 1 lồi giống Tắc kè (Gekko) 1 loài giống Thạch sùng dẹp (Hemiphyllodactylus) và 1 loài giống Thạch sùng (Hemidactylus) (bảng 3.1).
Ở tỉnh Húa Phăn ghi nhận 5 giống gồm 11 lồi, trong đó 4 lồi giống Thạch sùng dẹp (Hemiphyllodactylus), có 4 lồi giống Thạch sùng
(Hemidactylus), giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus), giống Tắc kè (Gekko) và giống Thạch sùng cụt (Gehyra) đều có 1 lồi (bảng 3.1).
Ở tỉnh Khăm Muôn ghi nhận 5 giống gồm 12 lồi, trong đó có 4 lồi nằm trong giống Tắc kè (Gekko), có 4 lồi giống Thạch sùng (Hemidactylus), 2 lồi giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus), giống Thằn lằn chân lá (Dixonius), và giống Thạch sùng cụt (Gehyra) đều có 1 lồi (bảng 3.1).
Đa dạng về lồi Giống Thằn lằn ngón (Cyrtodactylus) có số lượng lồi đa dạng nhất với 9 lồi, cịn lại như giống Thằn lằn chân lá (Dixonius), giống Tắc kè (Gekko), giống Thạch sùng (Hemidactylus), giống Thạch sùng dẹp (Hemipyllodactylus) đều 4 lồi và giống Thạch sùng cụt (Gehyra) có 3 lồi.