STT Chủng VSV tuyển chọn Chức năng Số lƣợng khuẩn lạc trung bình (108 CFU/ml) pH Kháng sinh Nhiệt độ pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 300mg/L 500mg/L 800mg/L 1000mg/L 20OC 30OC 40OC 50OC 1 VK01 Đối kháng héo xanh 4,6 2,3 4,4 3,8 3,5 5,7 3,3 4,6 4,6 4,5 4,8 6,3 4,2 2 VK14 1,6 3,5 5,3 1,3 2,7 4,5 2,2 3,0 - KTN KTN KTN KTN 3 VK03 Đối kháng thối nhũn 6,3 8,3 10,9 15,7 16,1 5,1 4,3 3,9 - KTN KTN KTN KTN 4 VK22 13,7 9,7 19,9 25,7 17,2 10,2 9,1 7,8 5,7 15,3 68,9 10,2 3,1 5 VK25 9,0 10,5 23,7 21,2 16,8 9,4 8,5 6,7 5,2 1,7 16,3 2,0 - 6 VK16 Phân giải K khó tiêu - - - 1,14 - KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN 7 VK21 1,2 1,2 0,9 1,3 0,9 1,0 0,8 0,8 0,5 0,4 0,8 1,7 - 8 VK23 - - - 0,96 - KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN 9 VK29 2,6 2,2 2,1 2,3 1,5 1,6 1,1 1,0 0,8 1,6 2,9 3,8 1,1 10 VK31 2,7 2,2 2,5 2,0 1,5 1,5 1,4 0,8 - KTN KTN KTN KTN 11 VK39 Phân giải P khó tiêu 4,4 2,2 1,5 3,4 1,8 2,2 2,5 - - KTN KTN KTN KTN 12 VK41 2,1 1,9 1,6 1,5 0,8 1,8 1,4 3,0 - KTN KTN KTN KTN 13 VK48 3,5 1,7 1,8 4,4 1,0 2,9 2,2 5,3 1,7 1,8 2,3 3,0 1,9 14 VK49 1,9 3,6 3,0 3,2 2,6 2,7 2,4 2,6 2,1 2,2 2,3 1,3 0,5 15 VK50 Cố định N 2,6 5,4 4,6 3,9 2,8 5,6 5,1 4,3 3,8 2,9 3,5 1,3 - 16 VK51 2,4 3,5 2,4 3,7 2,9 3,4 2,9 2,4 - KTN KTN KTN KTN 17 VK52 5,8 3,4 4,6 4,0 3,1 3,8 3,2 2,6 2,1 3,5 5,9 2,9 1,8 18 VK53 3,2 2,8 3,35 - - KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN KTN 19 VK55 5,4 2,6 2,0 3,1 2,6 5,1 4,7 4,1 3,5 2,4 3,6 - -
Khả năng thích ứng với pH môi trƣờng:
Việc đánh giá khả năng thích ứng của các chủng VK ở các mức pH khác nhau nhằm tuyển chọn các chủng có khả năng sinh trưởng được ở dải pH rộng. Giới hạn thích ứng pH của từng loại vi sinh vật khác nhau. Một số loại vi sinh vật có thể phát triển trong các môi trường axit, ngược lại cũng có một số loại thích hợp với môi trường có pH trung tính hoặc môi trường kiềm. Chủng vi sinh vật nào có khả năng thích ứng với khoảng pH rộng sẽ có khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển ở nhiều điều kiện pH khác nhau, phát huy hết các tiềm năng ứng dụng của chúng, và vì vậy chúng có thể được dùng để cải tạo đất ở nhiều vùng khác nhau.
Kết quả đánh giá tại Bảng 4.5 cho thấy khả năng thích ứng rộng của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn, có 16/19 ( chiếm 84,2% ) chủng vi khuẩn phát triển được trong khoảng pH từ 4-8, chỉ có 3/19 chủng vi khuẩn phát triển không đồng đều trong môi trường pH biến đổi ( gồm VK16, VK23 và VK53 ).
Khả năng sinh trưởng tối đa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn xuất hiện nhiều nhất tại môi trường pH 4-5, chiếm 62,5% trên tổng số 16 chủng vi khuẩn thích nghi rộng. Môi trường từ ít chua cho đến kiềm yếu ( pH từ 6-8 ) có 6/16 chủng còn lại đạt được tốc độ sinh trưởng tối đa ( hay số lượng khuẩn lạc xuất hiện lớn nhất ). Đặc biệt, trong môi trường trung tính ( pH=7 ), có mốt số chủng vi sinh vật sinh trưởng rất tốt, đạt mật độ tối đa lên tới 23,7x108
CFU/ml ( chủng VK25 tại pH=6 ) hay 25,7x108 CFU/ml ( chủng VK22 tại pH=7 ). Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các công trình công bố trước đây khi cho rằng vi khuẩn thuận lợi nhất trong môi trường trung tính hoặc ít chua ( Lê Xuân Phương 2016 ). Các chủng vi sinh vật không đáp ứng được khả năng thích ứng rộng với pH môi trường biến đổi sẽ được loại bỏ khỏi nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm, 03 chủng bị loại bỏ bao gồm: VK16, VK23 và VK53.
Hình 4.6. Đánh giá khả năng thích nghi môi trƣờng pH của các chủng VSV tuyển chọn
Khả năng kháng kháng sinh:
Trong môi trường tự nhiên, các sinh vật tồn tại có rất nhiều mối quan hệ từ cộng sinh, kí sinh,... Trong những điều kiện thích hợp vi sinh vật có thể cùng các sinh vật khác phát triển tốt nhưng khi môi trường không thuận lợi các vi sinh vật bị ức chế và có thể bị tiêu diệt thì chúng có khả năng tạo ra hàng rào bảo vệ chính nó để sinh trưởng và phát triển trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Theo Nguyễn Xuân Thành và cs. (2007) chủng nào có khả năng sinh trưởng phát triển trong điều kiện nồng độ kháng sinh cao thì chủng đó có khả năng chống chịu với điều kiện môi trường sống tốt hơn, có sức sống cao, sức cạnh tranh lớn dẫn phát huy hết các đặc tính tốt nhất. 16 chủng vi khuẩn đảm bảo sinh trưởng tốt trong môi trường pH rộng đã nghiên cứu tiếp tục được thử nghiệm đánh giá khả năng kháng kháng sinh.
Kết quả cho thấy có 10/16 chủng có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi trường chứa kháng sinh có nồng độ 300-1000 mg/L, 06 chủng không có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ kháng sinh lên đến 1000mg/L. Nguồn gốc các chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh tương đối đa dạng từ nguồn đất và cây khoai tây, bắp cải và ngô cho thấy khả năng kháng kháng sinh không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập mà tùy vào đặc tính của từng chủng. Qua kết quả đánh giá, thực hiện loại bỏ 06 chủng vi khuẩn gồm chủng
VK03, VK14, VK31, VK39, VK41 và VK51 không có khả năng kháng sinh rộng, 10 chủng còn lại được tiếp tục đánh giá khả năng chống chịu nhiệt độ.
Hình 4.7. Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng VSV tuyển chọn Khả năng thích ứng với nhiệt độ môi trƣờng: Khả năng thích ứng với nhiệt độ môi trƣờng:
Các nhân tố vật lý, hóa học, sinh học luôn có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật đặc biệt là nhiệt độ. Trên thực tế, nhiệt độ tăng lên làm tăng khả năng sinh trưởng của VSV, tăng khả năng tiết ra enzym ngoại bào, tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên đến mức giới hạn làm giảm khả năng hoạt động, sinh trưởng và phát triển của chúng. Dựa vào khoảng nhiệt độ ưa thích của các chủng VSV có thể chia làm 3 loại là VSV ưa nóng, VSV ưa ấm và VSV ưa lạnh. Màng tế bào của vi sinh vật ưa lạnh có chứa nhiều các axit béo không bão hòa, có thể giữ được trạng thái chất bán lưu ( semifluid ) khi gặp lạnh. VSV ưa ấm là các vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở 20- 450C. VSV ưa nóng thì nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất đối với chúng là 33-650C, đặc biệt một số tảo và nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao tới 55- 600C. Vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể sinh trưởng được ở những nhiệt độ cao hơn vi sinh vật nhân thật ( Nguyễn Lân Dũng và cs., 1979 ).
Việc đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến các chủng vi sinh vật nhằm chọn ra khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng tốt nhất của chúng cũng như
chọn ra các chủng có giải thích ứng nhiệt độ rộng. Nếu vi sinh vật nào có giải thích ứng nhiệt độ rộng thì chủng đó sinh trưởng và phát triển tốt ở các điều kiện tự nhiên khác nhau. Khả năng sinh trưởng đảm bảo trong điều kiện nhiệt độ cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình nhân sinh khối ở quy mô công nghiệp và khả năng thích ứng khi ứng dụng ngoài môi trường.
Nhìn chung, kết quả Bảng 4.5 cho thấy hầu hết 10 chủng VK đều thích ứng được với nhiệt độ thử nghiệm 20oC, 30oC, 40oC và 50oC, trong đó thích hợp nhất ở dải nhiệt độ từ 30 – 400C. Tại mức nhiệt độ 40oC chỉ có 1/10 chủng VK không thích ứng, tuy nhiên khi tăng nhiệt độ lên 50 oC thì số lượng chủng không thích ứng tăng lên thành 4/10 chủng. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào và Trịnh Thị Thúy An ( 2016 ) cũng chỉ ra rằng chỉ có 2 chủng trong 14 chủng vi khuẩn phân lập được thích nghi với nhiệt độ 350C ( 14,2% ). Kết quả đánh giá đối với các chủng vi khuẩn cố định đạm cũng phù hợp với nghiên cứu của Phạm Bích Hiên và cs ( 2003 ) cho thấy khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn
Azotobacter sinh trưởng bình thường là 25 – 30oC. So với các nghiên cứu trên thì các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này khả năng chịu nhiệt cao hơn, khi có tới 6/10 chủng vi khuẩn phân lập được thích nghi với điều kiện nhiệt độ lên đến 500C ( đạt tỷ lệ 60% ). Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng chế phẩm ở những vùng núi khô hạn, thường xuyên chịu những đợt nắng nóng kéo dài làm cho thời tiết có nhiệt độ cao.
Các chủng VK được loại bỏ do không đáp ứng được yêu cầu về khả năng chống chịu nhiệt độ bao gồm chủng VK21, VK25, VK50, VK55.
Lựa chọn các chủng VSV có đặc tính sinh học đảm bảo:
Tổng hợp từ kết quả đánh giá, đề tài lựa chọn được 05 chủng VK để sản xuất chế phẩm bao gồm: Chủng VK01 có khả năng đối kháng với vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh; Chủng VK22 có khả năng đối kháng với vi khuẩn E.carotovora gây bệnh thối nhũn; Chủng VK29 có khả năng giải phóng kali khó tan; Chủng VK48 có khả năng giải phóng photpho khó tan; và Chủng VK52 có khả năng cố định nito phân tử. Thông tin đánh giá tổng hợp về hình thái, đặc tính sinh học và khả năng đối kháng với nguồn bệnh và tổng hợp, giải phóng dinh dưỡng từ tự nhiên của các chủng vi sinh vật này được lựa chọn qua các nghiên cứu được trình bày tại Bảng 4.6.
52