Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy người ta tìm cách để tăng lượng lân dễ tan trong đất bằng cách bón phân. Nhưng 2/3 lượng lân bón vào đất bị chuyển hóa trở thành lân khó tiêu khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rữa trôi đi. Do đó hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều. Các vi sinh vật phân giải lân khó tan đã giải quyết được vấn đề này. Chúng vừa giảm được lượng phân lân bón cho cây, đồng thời huy động được cả lượng lân khó tiêu trong đất. Với những lợi ích như vậy, các vi sinh vật phân giải lân được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Nhiều công trình nghiên cứu ở châu Âu, Mỹ và Ấn Độ và các nghiên cứu trong nước đã cho thấy hiệu quả to lớn của các vi sinh vật phân giải lân.
Datta et al. (1982) đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus có khả năng phân giải lân khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc Ấn Độ. Chủng này vừa có khả năng sinh IAA (Idolactic axit)- là hooc môn sinh trưởng rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hóa lân khó tan.
Grime and Mount (1984) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas Putida
phân lập từ đất xung quanh cây họ đậu Phaseollus Vulgaris. Thấy rằng khi bổ sung P.Putida vào đất trồng làm cho cây họ đậu này tạo nhiều nốt sần hơn, do đó tăng khả năng hấp thụ lân của cây.
Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957 cho thấy các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus, các chủng nấm thuộc loài Penicillium,
Aspergillus có khả năng chuyển hóa photphat không tan thành dạng dễ hòa tan ở
trong đất nhờ tiết ra các acid hữu cơ như formic, acetic, lactic, propionic, fumaric, glucolic và acid succinic. Những acid này làm giảm pH và hòa tan các dạng photphate khó (Reynaldo Fraga and Hilda Rodriguez, 1999).
Ở Liên xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với sự có mặt của B. megateirum var phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên xô và các nước Đông Âu, làm tăng năng suất cây trồng 5 – 10% so với đối chứng.Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng Phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng đã cho kết quả tăng đáng kể so với đối chứng. Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phân giải lân có tác dụng tương đương với việc bón 50kg P2O5/ha (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada cho thấy bón vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 50 – 75% lượng lân cần bón bằng quặng nghèo P2O5 mà năng suất, chất lượng không hề thay đổi (Gaur, 1992). Sử dụng chủng Pseudomonas
striata khi bón quặng phosphate và superphosphate cũng làm tăng đáng kể năng
suất khoai tây (Gil-Sotres, Trasar-Cepeda, Leio’s and Seoanc, 2005).
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng N trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37- 53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10- 14,3% so với đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng tốt hơn xử lý đơn chủng.
Perez (2007) đã nghiên cứu phân lập được 130 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải phosphat khó tan ở Venezuela. Tuy nhiên, không có chủng nào có hoạt tính phân giải phosphate Fe và Al. Tác giả cũng chọn được 10 chủng có tiềm năng để nghiên cứu tiếp thuộc các chi Raltonia, Pantoea, Serratia.
có hoạt tính phân giải phosphate và kích thích sinh trưởng đối với cây trồng thuôc chi mới là Acenitobacter.
Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp, ứng dụng trên hàng chục triệu ha (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững. Việt Nam đã có khá nhiều nghiên cứu về vi sinh vật phân giải lân. Thập kỉ 90 thế kỷ XX các vi sinh vật phân giải lân sau khi được nhân sinh khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩm vi sinh vật phân giải lân hoặc phối trộn với chất hữu cơ để tạo thành phân lân hữu cơ vi sinh vật. Nghiên cứu khả năng tiết enzyme photphataza của 10 chủng vi sinh vật hòa tan lân và nhận thấy rằng ngoài khả năng hòa tan lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân (Nguyễn Thị Phương Chi và Phạm Thanh Hà, 1999).
Phạm Văn Toản và Phạm Bích Hiên (2015) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate vô cơ khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium. Kết quả cho thấy chúng có khả năng tổng hợp 20 – 100 microgam/ml môi trường nuôi cấy. Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên khả năng phân giải photphat khó tan của hai chủng nấm sợi
Aspergillus awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1.Tác giả nghiên cứu 7
nguồn cung cấp nitơ khác nhau lên khả năng phân giải photphat của Aspergillus
awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1. Kết quả cho thấy KNO3, NaNO3,
(NH4)2SO4 là những nguồn nitơ tốt nhất cho môi trường nuôi chủng MN1 tạo khả năng phân giải photphat cao. Còn đối với chủng ĐT1 là NH4Cl.
Nghiên cứu gần đây nhất đối với vi sinh vật phân giải lân trên đất bazan nâu đỏ là sử dụng chế phẩm vi sinh phân giải lân (50g) cho 1 ha cà phê có tác dụng tương đương với 34.3kg P2O5/ha. Nghiên cứu cũng cho thấy, việc bón thêm vi sinh vật phân giải lân làm tăng số lượng vi sinh vật phân giải lân trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải lân khó tan trong đất 23 – 35% (Võ Thị Lài, 2006).
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp hoặc giải phóng chất dinh dưỡng từ tự nhiên và có khả năng đối kháng với một số bệnh phổ biến trên cây trồng.
3.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
-Vềkhông gian: phòng thí nghiệm Bộ môn vi sinh vật – Khoa Môi Trường - Về thời gian: 9/2018-10/2019
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Phân lập tuyển chọn các chủng giống vi khuẩn có chức năng phân giải lân, phân giải kali, cố định đạm và đối kháng với một số dịch bệnh phổ biến trên cây trồng từ vùng rễ và nội sinh trong thân cây từ một số loại cây trồng chính tại Hà nội và các tỉnh lân cận.
- Đánh giá các hoạt tính, đặc tính sinh học của các chủng VK phân lập được để lựa chọn những chủng VK có những đặc điểm tốt để từ đó sản xuất cũng như đánh giá chất lượng chế phẩm
- Thực hiện thí nghiệm bón chế phẩm cho cây rau mồng tơi ở quy mô chậu vại để đánh giá hiệu quả của nó
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp thu thập số liệu thứ cấp
- Thu thập số liệu từ các nguồn báo chí, internet, bài báo khoa học trong nước và quốc tế.
- Kế thừa có chọn lọc từ những tài liệu và nghiên cứu của các nhà khoa học có liên quan đến nghiên cứu.
3.4.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Mẫu đất, rễ cây và mẫu cây được thu thập tại vùng trồng cây chuyên canh như ngô và rau củ tại Hà Nội và Bắc Giang:
- Mẫu đất được lấy ở vùng rễ cây có độ sâu 5-15cm.
- Mẫu rễ cây rau, cây ngô khỏe cùng được thu thập làm nguồn mẫu để phân lập vi khuẩn nội sinh. Lựa chọn cây khỏe, thời điểm trước thu hoạch. Tiến hành nhổ, rũ nhẹ nhằm loại bỏ bớt lớp đất bám ở vùng rễ.
- Mẫu cây (sử dụng để phân lập VK đối kháng bệnh thối thân (thối nhũn do VK) và héo xanh vi khuẩn): Chọn và lấy cây ngô, cây bắp cải, cây khoai tây... khỏe, đang ở thời kì sinh trưởng phát triển mạnh trước khi thu hoạch làm mẫu để phân lập vi khuẩn đối kháng.
Thu thập tổng cộng 15 mẫu đất, mẫu cây và rễ cây tại các khu vực và loại cây trồng khác nhau, thời gian thu mẫu từ tháng 9/2018- tháng 3/2019 (chi tiết tại
Bảng 3.1). Các mẫu được đựng trong túi zip sạch, bảo quản ngay ở 4oC và tiến
hành phân lập vi khuẩn trong vòng 01 tuần.
Bảng 3.1. Thông tin mẫu nghiên cứu
STT Kí hiệu mẫu Nguồn mẫu Cây trồng
1 M1 Yên Dũng- Bắc Giang Khoai tây
2 M2 Yên Dũng-Bắc Giang Ngô
3 M3 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
4 M4 Gia Lâm - Hà Nội Ngô
5 M5 Long Biên – Hà Nội Ngô
6 M6 Yên Dũng - Bắc Giang Cà chua
7 M7 Yên Dũng - Bắc Giang Bắp cải
8 M8 Gia Lâm - Hà Nội Mồng tơi
9 M9 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
10 M10 Khoa Môi Trường- HVNNVV Cải cúc
11 M11 Khu Khí tượng, Khoa Môi trường, HVNNVN Cà chua
12 M12 Long Biên -Hà Nội Ngô
13 M13 Gia Lâm - Hà Nội Bắp cải
14 M14 Khu Khí tượng, Khoa Môi trường, HVNNVN Dưa chuột
15 M15 Kim Lan - Hà Nội Mồng tơi
3.4.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn
3.4.3.1. Xử lí mẫu và lập dãy pha loãng
Đối với mẫu đất: cân 10g đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước vô
thu được nồng độ pha loãng 10-1 tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-2 và 10-3.
Đối với mẫu rễ cây: rễ cây khỏe sau khi được loại bỏ hoàn toàn đất bằng
cách rũ nhẹ trong không khí, rễ được rửa lại bằng nước vô trùng, và cồn 950 và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần, nghiền nhỏ mẫu sau đó thu dịch pha loãng đến nồng độ 10-2.
Đối với mẫu cây: Mẫu cây được rửa sạch đất bám ở thân và lá. Để loại trừ
các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, lá dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt thân, lá thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu bằng cồn 95% trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa. Cuối cùng, nghiền nhỏ mẫu và thực hiện thao tác tương tự với mẫu rễ và thu dịch.
3.4.3.2. Cấy mẫu
Sử dụng môi trường dinh dưỡng chuyên tính bán rắn để phân lập VK (chi tiết tại bảng 3.2): nhỏ 0,1ml dịch đã được chuẩn bị ở trên tương ứng với các nồng độ pha loãng khác nhau tùy thuộc vào nguồn mẫu vào hộp lồng có chứa môi trường chuyên tính bán rắn với 4 lần lặp lại. Các đĩa thạch được nuôi trong tủ nuôi 28°C trong 1 tuần. Trong quá trình nuôi kiểm tra sự hình thành khuẩn lạc hàng ngày (đánh dấu khuẩn lạc, đếm số lượng khuẩn lạc). Sau 1 tuần, tiến hành làm thuần khuẩn lạc vi khuẩn bằng cách cấy truyền sang các đĩa thạch mới dựa vào sự khác nhau về hình thái, kích thước, mầu sắc của khuẩn lạc. Những chủng vi khuẩn thuần khiết sẽ được lưu giữ trong ống giống thạch nghiêng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
(i) Phân lập vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn đối kháng từ mẫu đất, rễ và thân lá ban đầu bằng môi trường Bacillus
(ii) Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải kali: nuôi cấy trên môi trường Alexandrov.
(ii) Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải lân: nuôi cấy trên môi trường kiểm tra VSV phân giải hợp chất photpho vô cơ khó tan.
(iii) Phân lập vi khuẩn có khả năng cố định đạm: nuôi cấy trên môi trường
Bảng 3.2. Thành phần môi trƣờng phân lập
STT Tên môi tƣờng Thành phần Khối lƣợng
1 Basillus subtilis
Pepton 1g
Gluco 14g
Dung dịch muối tiêu chuẩn 10ml
Thạch Agar 20g Nước cất 1000ml 2 Alexanderov Glucose 10g MgSO4.7H2O 0,5g CaCO3 1g FeCl3 0,005g Kaolin 3g Agar 20g Nước cất 1000ml 3 Ashby Glucozo 10g K2HPO4 0,2 – 0,5g MgSO4 0,2g K2SO4 0,1g CaCO3 5g Thạch 20g Nước cất 1000ml 4
Môi trƣờng kiểm tra VSV
phân giải hợp chất
photpho vô cơ khó tan
Glucozo 10g MgSO4.7H2O 0,25g MnSO4 vết Ca3(PO4)2 5g FeSO4 vết (NH4)2SO4 0,5g Nấm men 0,5g KCl 0,2g Thạch 20g Nước cất 1000ml
3.4.4. Phƣơng pháp đánh giá đặc tính sinh học của vi khuẩn
3.4.4.1. Thời gian mọc
Các chủng vi sinh vật phân lập được sẽ được cấy trên môi trường chuyên tính, nuôi ở 28C và theo dõi thời gian mọc. Chủng vi sinh vật mọc trước 72 giờ
được đánh giá là mọc nhanh, mọc sau 72 giờ là mọc chậm.
3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi sinh vật: Cấy từng chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên tính, nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau 10o
C; 20oC; 30oC; 40oC, đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.4.4.3. Khả năng thích ứng tính pH
Giá trị pH của môi trường được điều chỉnh ở các ngưỡng khác nhau (4, 5, 6, 7, 8) bằng cách bổ sung dung dịch đệm pH pha bằng Na2HPO4 và K2HPO4 vào môi trường nuôi cấy. Môi trường sau đó được đem hấp khử trùng và đổ vào đĩa petri, cấy vi sinh vật phân lập được trên các đĩa môi trường có pH khác nhau đó và đem nuôi ở 28oC sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.4.4.4. Xác định khả năng kháng kháng sinh
Cân các mức kháng sinh Steptomyxin (300; 500; 800; 1000 mg/l) cho vào môi trường chuyên tính (đã được khử trùng), sau đó đổ vào đĩa petri, cấy vi sinh vật và đem nuôi ở 28oC sau đó đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.4.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh
3.4.5.1. Lựa chọn phương pháp đánh giá
Đánh giá khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh theo phương pháp của Soad et al (2004) và Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9300:2014
Vi khuẩn gây bệnh héo xanh và thối nhũn (Ralstonia solanacearum và
E.carotovora) được cung cấp bởi PGS. Hà Viết Cường, Trung tâm bệnh cây nhiệt
đới, nay là bệnh viện cây trồng, Học viện NNVN.
Khả năng đối kháng được xác định bằng việc đo đường kính vòng đối kháng (vòng kháng khuẩn). Kích thước vòng đối kháng (mm) của vi sinh vật được tính theo công thức dưới đây:
Kích thƣớc vòng đối kháng (mm) = D - d
Trong đó:
D là đường kính vòng đối kháng, tính bằng milimet (mm); d là đường kính lỗ giếng, tính bằng milimet (mm).
3.4.5.2. Thao tác thực hiện thí nghiệm
Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh (vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh và E.carotovora gây bệnh thối nhũn):
- Lấy một vòng que cấy vi khuẩn gây bệnh cấy vào môi trường dịch thể King’B đã chuẩn bị sẵn. Nuôi cấy lắc trong thời gian 48h, ở nhiệt độ từ 28-30°C; đảm bảo mật độ tế bào vi khuẩn không nhỏ hơn 108
CFU/ml. Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật đối kháng:
- Lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào bình tam giác chứa môi trường chuyên tính dịch thể đã chuẩn bị sẵn.
- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp từ 28-30°C trong 2 ngày.
Bước 3: Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng:
- Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch vi khuẩn gây bệnh cấy vào đĩa petri chứa môi trường King’B đã chuẩn bị sẵn. Dùng que chang vô trùng chang đều cho đến khi dung dịch huyền phù vi khuẩn thấm đều trên bề mặt thạch. Đợi từ 20-30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống nghiệm vô trùng đường kính 1cm đục lỗ thạch ở phần tâm của đĩa petri. Dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn loại bỏ phần thạch vừa đục.
- Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch vi sinh vật đối kháng đưa vào các giếng đã được loại bỏ thỏi thạch, giữ ở điều kiện thích hợp tùy thuộc từng chủng