Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy nghiền đồng hóa Bead Bug 6 Bench mark, Trung Quốc

2 Máy ly tâm Eppendorf, Đức

3 Máy đo pH Hanna Instruments, Ý

4 Máy Vontex Dlab, Trung Quốc

5 Máy spindown Wealtex, Đài Loan

6 Máy khuấy từ JSR, Hàn Quốc

7 Máy lọc nước Canada Bio, Anh

8 Tủ lạnh -20oC Sanyo, Nhật Bản

9 Nồi hấp khử trùng Hirayama, Nhật Bản

10 Cân điện tử Ohaus, Trung Quốc

11 Tủ sấy Esco isotherm, Việt Nam

12 Micropipette Eppendorf, Đức

13 Đầu micropipette các loại Eppendorf, Đức

3.2.2. Hóa chất nghiên cứu

Thực hiện đề tài nghiên cứu đã sử dụng các hóa chất sau: Capture antibody (Agritest - Ý), Conjugate antibody (Agritest - Ý), Negative Citrus (Agritest - Ý), Positive Citrus (Agritest - Ý), NaHCO3 (Merck - Đức), NaCl (Merck - Đức), KH2PO4 (Merck - Đức), Na2HPO4 (Merck - Đức), KCl (Merck - Đức), MgCl2 (Merck - Đức), Na2CO3 (Merck - Đức), NaOH (Merck - Đức), PVP (Polyvinylpyrrolidone) (Merck - Đức), Tween 20 (Merck - Đức), Dietanolammine (Sigma - Mỹ), BSA (Bovine Serum Albumin) (Sigma - Mỹ),…

Các đệm sử dụng trong đề tài:

1. Đệm Phosphateb - buffered saline (PBS buffer):

- NaCl: 8,0 g - KH2PO4: 0,2 g - Na2HPO4: 1,15 g - KCL: 0,2 g - H2O: 1.000 ml - pH: 7,4

2. Đệm tách chiết (Extraction General): - PVP MW 2400: 20,0 g - Tween 20: 0,5 ml - PBS: 1.000 ml - pH: 7,4 3. Đệm phủ (Coating buffer): - Na2CO3: 1,59 g - NaHCO3: 2,93 g - H2O: 1.000 ml - pH: 9,6

4. Đệm ủ kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate buffer): - PVP (MW 2400): 20,0 g

- BSA: 2,0 g

- PBS: 1.000 ml

- pH: 7,4

5. Đệm cơ chất (Substrate buffer):

- Dietanolammine: 97,0 ml

- MgCl2: 0,095 g

- H2O: 1.000 ml

- pH: 7,4

6. Đệm rửa (Washing buffer):

- Tween 20: 0,5 ml

- PBS: 1.000 ml

- pH: 7,4

3.3. Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh Tristeza trên cây cam, quýt.

- Nội dung 2: Xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh Tristeza.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện rửa. + Nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu. + Nghiên cứu thời gian ủ mẫu phân tích.

+ Xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA.

- Nội dung 3: Thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh Tristeza

trên các mẫu thu thập.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích từ mơ thực vật

Mẫu phân tích là mẫu lá được chuẩn bị theo phương pháp của Bar-Joseph M. và cộng sự năm 1979 [10] với biến đổi nhỏ để phù hợp với phịng thí nghiệm. Các bước tiến hành như sau:

- Bước 1: Lấy 0,2 g mẫu lá cam, quýt, cắt nhỏ và cho vào ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 2 viên bi inox và 1.200 µl dung

dịch đệm tách chiết. Đặt eppendorf chứa mẫu vào máy đồng hóa, nghiềm mẫu 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây ở tốc độ 4.000 vòng/phút để thu được dung dịch đồng nhất.

- Bước 2: Ly tâm mẫu ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, ở nhiệt độ 10oC. - Bước 3: Dùng micropipet chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới. - Bước 4: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4oC để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Lưu ý: Chỉ chuẩn bị mẫu ngay trước khi tiến hành thực hiện phản ứng ELISA, không chuẩn bị mẫu trước quá 1 ngày.

3.4.2. Phương pháp ELISA

Kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza được thực hiện theo quy trình của Borah M. và cộng sự năm 2014 [12] có sự thay đổi nhỏ. Quy trình cụ thể như sau:

Bước 1: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu

- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Bổ sung 200 µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng. - Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng

- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.

Bước 2: Bổ sung mẫu phân tích

- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).

- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ đĩa ELISA 2h - 4h ở 37oC.

- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.

Bước 3: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme

- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ đĩa ELISA 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.

- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.

Bước 4: Thêm cơ chất

- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Bổ sung 200 µl cơ chất vào giếng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt thường (khoảng 1-3h).

Bước 5: Kiểm tra kết quả

Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngừng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50 µl NaOH 3M.

3.4.3. Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA

Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA so với phương pháp kiểu hình được tính theo cơng thức của Walker H.K [27] như sau:

Độ nhạy (%) = Số mẫu dương tính thật x 100

Số mẫu dương tính thật + số mẫu âm tính giả

Độ đặc hiệu (%) = Số mẫu âm tính thật x 100

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh Tristeza trên cây cam, quýt

Để thực hiện đề tài nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập 20 mẫu cam quýt tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Bảng 4.1. Các mẫu cam, quýt thu thập được STT Ký hiệu

mẫu Địa điểm thu thập Dịng/Giống Kiểu hình

bệnh 1 CBH -1 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Không bị bệnh

2 CBH -2 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Không bị bệnh

3 CS1-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam sành Không bị bệnh

4 CS2-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam sành Không bị bệnh

5 CS4-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam sành Không bị bệnh

6 CS5-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam sành Không bị bệnh

7 CS0-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam sành Không bị bệnh

8 CC1 Trường Đại học Nông Lâm Cam canh Không bị bệnh

9 CC2 Trường Đại học Nông Lâm Cam canh Không bị bệnh

10 QN4 Trường Đại học Nông Lâm Quýt ngọt Không bị bệnh

11 V2-1 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

12 V2-2 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

13 V2-3 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

14 V2-4 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

15 V2-5 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

16 V2-6 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

17 V2-7 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

18 V2-8 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

19 V2-9 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

20 V2-10 Trường Đại học Nông Lâm Cam chanh Bị bệnh

Trong 20 mẫu cam quýt sử dụng cho nghiên cứu có 10 mẫu thu thập tại vườn cam sản xuất của trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và 10 mẫu thu tập tại vườn sưu tập giống cam quýt Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm.

Mười trong số 20 mẫu thu thập mang kiểu hình bị bệnh tristeza như: lá vàng, kích thước nhỏ, cong, biến dạng, gân lá trong, mờ khi đưa lên ánh sáng và gân chính lõm, gân phụ sưng lên, khi tác nhân gây bệnh lây lan đến đâu sẽ gây khô và chết cành, cây. Cây bị bệnh nặng thân bị lõm khi bóc vỏ. Mười mẫu cịn lại có kiểu hình bình thường, khơng biểu hiện bệnh.

Hình 4.1. Hình ảnh cây bị cam bị nhiễm bệnh tristeza ở các mức độ khác nhau (A); Lá cây cam bị bệnh tristeza và lá bình thường (B) tại vườn sản xuất,

trường Đại học Nông Lâm

4.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh Tristeza trên cây có múi Tristeza trên cây có múi

Để xây dựng được quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza trên cây cam, quýt cần phải tìm hiểu các điều kiện phù hợp ở từng bước của quy trình bao gồm: phương pháp chuẩn bị mẫu, hàm lượng BSA sử dụng, điều kiện rửa, thời gian ủ cơ chất, thời gian ủ mẫu phân tích và nồng độ mẫu tối thiểu cho phản ứng ELISA. Dưới đây là kết quả nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả năng phát hiện bệnh tristeza.

4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu lá được nghiền trong điều kiện thông thường và điều kiện lạnh sau đó được sử dụng làm mẫu phân tích cho quy trình ELISA, đánh giá hiệu quả của kỹ thuật thơng qua cường độ màu hình thành giữa giếng chứa mẫu bị bệnh, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính ở các cây bị bệnh. Kết quả của 2 thí nghiệm được thể hiện ở hình 4.2 dưới đây:

Hình 4.2. Kết quả phát hiện bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA ở các điều kiện tách chiết mẫu khác nhau: TN1. Mẫu được chuẩn bị

ở điều kiện thường, TN2. Mẫu được chuẩn bị ở điều kiện lạnh

Kết quả thể hiện trong hình 4.2 cho thấy:

Khi mẫu được tách chiết ở nhiệt độ thường (nhiệt độ phịng thí nghiệm), mẫu kiểm chứng dương tính (hàng A, cột 1, TN1) cho cường độ màu vàng cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (hàng B, cột 1, TN1). Kết quả này hoàn toàn phù hợp. Tuy nhiên, ở các mẫu bị bệnh (hàng C đến hàng G, cột 1 và cột 2, TN1) cho tín hiệu màu khơng đều. Ở giếng C, cột 1, giếng D, cột 2 và giếng F, cột 1 có cường độ màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính là phù hợp với kết quả kiểu hình bị bệnh nhưng các giếng cịn lại có cường độ tín hiệu màu tương đương với mẫu kiểm chứng âm tính. Đây là những kết quả âm tính giả, khơng đúng với kết quả kiểu hình bị bệnh. Điều này chứng tỏ rằng: chuẩn bị mẫu ở nhiệt độ phịng thí nghiệm cho kết quả phân tích khơng ổn định. Lý do giải thích cho điều này có thể là khi đồng hóa trong điều kiện thơng thường, một hàm lượng lớn protein kháng nguyên của virus gây bệnh tristeza bị biến tính, khơng có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể.

Khi mẫu được đồng hóa trong điều kiện lạnh (đệm tách chiết được xử lý -20oC trước khi sử dụng và quá trình ly tâm mẫu được thực hiện ở 10oC), các giếng ELISA đều cho cường độ màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính (TN2). Các kết quả này chứng tỏ các mẫu phân tích mang mầm bệnh tristeza đúng với kết quả kiểu hình.

Từ kết quả thí nghiệm này cho thấy, mẫu nên được tách chiết ở điều kiện lạnh để tránh làm biến tính protein kháng nguyên của virus gây bệnh tristeza.

4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer Conjugate buffer

Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin – BSA) là protein được sử dụng nhiều trong các kỹ thuật lai phân tử với vai trò là chất blocking. BSA có khả năng liên kết vào giếng ELISA tại những vị trí khơng có kháng thể bắt giữ. Do đó, ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu giữa kháng thể cộng hợp enzyme với bề mặt của giếng ELISA. Ngồi ra, BSA có tác dụng giảm bớt tín hiệu nền, tăng cường các tín hiệu lai đặc hiệu [22], [29]. Vì vậy, để tăng cường tính đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza chúng tôi tiến hành thử nghiệm nồng độ BSA được bổ sung vào trong đệm cộng hợp (conjugate buffer). Kết quả được thể hiện trong hình 4.3.

Hình 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lương BSA pha loãng trong đệm Conjugate buffer. TN3: hàm lượng BSA 2,0 g/l; TN4: Hàm lượng BSA 4,0 g/l

Kết quả nghiên cứu so sánh 2 nồng độ BSA khác nhau (2,0 g/l ở TN3 và 4,0 g/l ở TN4) cho thấy: khi đệm cộng hợp được bổ sung BSA với hàm lượng 2,0 g/l (TN3 hình 4.3), khơng có sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng phân tích mẫu bị bệnh và mẫu không bị bệnh. Điều này chứng tỏ

hàm lượng BSA khơng đủ để liên kết vào các vị trí trống tại các giếng ELISA dẫn đến kháng thể cộng hợp enzyme đã liên kết khơng đặc hiệu vào các vị trí này làm cho tín hiệu màu của phản ứng tăng lên.

Khi thử nghiệm với hàm lượng BSA là 4,0 g/l (TN4 hình 4.3) ở các giếng phân tích các mẫu bị bệnh (cột 1) có cường độ tín hiệu màu cao hơn rõ ràng so với cường độ tín hiệu màu của mẫu kiểm chứng âm tính. Các giếng phân tích mẫu khơng bị bệnh (cột 2), cường độ tín hiệu màu thu được thấp hơn hoặc bằng mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết quả kiểu hình.

Kết quả này cho thấy, sử dụng nồng độ BSA 4,0 g/l trong đệm cộng hợp giúp tăng độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza ở cam, quýt. Do đó, trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tơi sử dụng BSA với nồng độ 4,0 g/l.

4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện rửa

Trong kỹ thuật ELISA, các bước rửa có vai trị đặc biệt quan trọng giúp loại bỏ các phân tử lai không đặc hiệu nhưng phải giữ được các phân tử đã được liên kết đặc hiệu tại các giếng. Trong thí nghiệm này, chúng tơi thử nghiệm phương pháp rửa 4 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa (washing buffer) và phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa. Kết quả phân tích ELISA phát hiện bệnh tristeza ở 2 điều kiện rửa này được thể hiện trong hình 4.4.

Hình 4.4. Kết quả phát hiện bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA ở các điều kiện rửa khác nhau. C1: Rửa 4 lần; C2: Rửa 3 lần

Kết quả thu được thể hiện trong hình 4.4 cho thấy khơng sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng tương ứng trong 2 cách rửa. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật ELISA cũng phù hợp với kết quả kiểu hình. Như vậy, để giảm thời gian phân tích, chúng tơi sử dụng phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa.

4.2.4. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu

Trong kỹ thuật ELISA này, kháng thể phát hiện được sử dụng là loại kháng thể cộng hợp với enzyme alkaline phosphatase, cơ chất được sử dụng để phát hiện là p- nitrophenol photphate. Dưới tác dụng của alkaline phosphatase, nhóm phosphate từ alkaline phosphatase không màu sẽ bị loại bỏ tạo thành sản phẩm p-nitrophenol có màu có thể quan sát bằng mắt thường [9]. Do đó, hàm lượng p-nitrophenol photphate có thể ảnh hưởng đến sự hành thành tín hiệu màu của kỹ thuật ELISA.

Thời gian ủ cơ chất sẽ liên quan đến lượng sản phẩm p-nitrophenol được hình thành và do đó ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu màu của phản ứng ELISA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo dõi thời gian để kết quả ELISA hiển thị rõ ràng và đặc hiệu. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5 dưới đây:

Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu

a. 1h sau khi thêm cơ chất; b. 2h sau khi thêm cơ chất; c. 3h sau khi thêm cơ chất;