Kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh tristeza được thực hiện theo quy trình của Borah M. và cộng sự năm 2014 [12] có sự thay đổi nhỏ. Quy trình cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu
- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200 µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng. - Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 2: Bổ sung mẫu phân tích
- Chuẩn bị mẫu phân tích thu được như ở trên và mẫu kiểm chứng của hãng Agritest (Ý).
- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ đĩa ELISA 2h - 4h ở 37oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 3: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme
- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Conjugate buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ đĩa ELISA 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.
- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm Washing buffer ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.
Bước 4: Thêm cơ chất
- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate trong dung dịch đệm Substrate buffer theo tỷ lệ 1/10 (m/v) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Bổ sung 200 µl cơ chất vào giếng.
- Ủ ở nhiệt độ phòng đến khi phát ra tín hiệu nhận biết có thể quan sát bằng mắt thường (khoảng 1-3h).
Bước 5: Kiểm tra kết quả
Quan sát tín hiệu màu phát ra ở các giếng bằng mắt thường, so sánh với kết của các mẫu đối chứng dương tính, âm tính. Có thể ngừng phát tín hiệu bằng cách thêm vào mỗi giếng 50 µl NaOH 3M.