Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện rửa- 123docz.net

Trong kỹ thuật ELISA, các bước rửa có vai trò đặc biệt quan trọng giúp loại bỏ các phân tử lai không đặc hiệu nhưng phải giữ được các phân tử đã được liên kết đặc hiệu tại các giếng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm phương pháp rửa 4 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa (washing buffer) và phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa. Kết quả phân tích ELISA phát hiện bệnh tristeza ở 2 điều kiện rửa này được thể hiện trong hình 4.4.

Hình 4.4. Kết quả phát hiện bệnh tristeza bằng kỹ thuật ELISA ở các điều kiện rửa khác nhau. C1: Rửa 4 lần; C2: Rửa 3 lần

Kết quả thu được thể hiện trong hình 4.4 cho thấy không sự khác biệt về cường độ tín hiệu màu giữa các giếng tương ứng trong 2 cách rửa. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật ELISA cũng phù hợp với kết quả kiểu hình. Như vậy, để giảm thời gian phân tích, chúng tôi sử dụng phương pháp rửa 3 lần, mỗi lần ngâm 3 phút trong dung dịch đệm rửa.

4.2.4. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu

Trong kỹ thuật ELISA này, kháng thể phát hiện được sử dụng là loại kháng thể cộng hợp với enzyme alkaline phosphatase, cơ chất được sử dụng để phát hiện là p- nitrophenol photphate. Dưới tác dụng của alkaline phosphatase, nhóm phosphate từ alkaline phosphatase không màu sẽ bị loại bỏ tạo thành sản phẩm p-nitrophenol có màu có thể quan sát bằng mắt thường [9]. Do đó, hàm lượng p-nitrophenol photphate có thể ảnh hưởng đến sự hành thành tín hiệu màu của kỹ thuật ELISA.

Thời gian ủ cơ chất sẽ liên quan đến lượng sản phẩm p-nitrophenol được hình thành và do đó ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu màu của phản ứng ELISA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo dõi thời gian để kết quả ELISA hiển thị rõ ràng và đặc hiệu. Kết quả được thể hiện trong hình 4.5 dưới đây:

Hình 4.5. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ cơ chất hiện màu

a. 1h sau khi thêm cơ chất; b. 2h sau khi thêm cơ chất; c. 3h sau khi thêm cơ chất; d. 4h sau khi thêm cơ chất

Kết quả trên hình 4.5 cho thấy: Sau 1h ủ cơ chất (hình 4.5a), chưa có tín hiệu màu xuất hiện ở cả mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính và các

mẫu phân tích, chứng tỏ thời gian ủ chưa đủ để enzyme chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu. Sau khi ủ cơ chất 2h (hình 4.5b), các giếng bắt đầu xuất hiện màu vàng nhạt, có thể quan sát bằng mắt thường tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc giữa giếng kiểm chứng dương tính và các mẫu phân tích so với mẫu kiểm chứng âm tính chưa rõ ràng. Sau thời gian ủ 3h (hình 4.5c), tín hiệu màu xuất hiện rõ ràng, dễ nhận biết bằng mắt thường. Đồng thời, cường độ tín hiệu màu giữa mẫu kiểm chứng dương tính khác biệt hoàn toàn với mẫu kiểm chứng âm tính. Các mẫu phân tích có cường độ tín hiệu màu cao hơn hẳn so với mẫu kiểm chứng âm tính là phù hợp với kết quả phân tích của mẫu bị bệnh tristeza. Kết quả này hoàn toàn đặc hiệu. Khi tăng thời gian ủ cơ chất lên 4h (hình 4.5d), cường độ tín hiệu màu cao nhưng không có sự khác biệt giữa mẫu kiểm chứng âm tính với các mẫu còn lại. Đây là kết quả phân tích không đặc hiệu.

Từ kết quả trên cho phép kết luận rằng: trong kỹ thuật ELISA này, thời gian ủ cơ chất phù hợp nhất là 3h.

4.2.5. Kết quả nghiên cứu thời gian ủ mẫu phân tích

Thời gian ủ mẫu của phản ứng ELISA sẽ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của kháng nguyên với kháng thể bắt giữ (capture antibody). Để nghiên cứu ảnh hưởng này, các mẫu được ủ trong giếng ELISA trong 2h và 4h trước khi được rửa để loại bỏ các phân tử lai không đặc hiệu. Kết quả phản ứng ELISA được thể hiện trong hình 4.6 dưới đây:

Hình 4.6. Kết quả phân tích ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu phân tích a. ủ 2h; b. ủ 4h

Kết quả phân tích trên hình 4.6 cho thấy: tăng thời gian ủ cơ mẫu từ 2h lên 4h, cường độ tín hiệu màu tăng lên và hoàn toàn quan sát được bằng mắt thường. Tín hiệu màu ở mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu phân tích đều cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính là hoàn toàn đặc hiệu. Như vậy, thời gian ủ mẫu phân tích là 4h phù hợp cho kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza được phát triển trong nghiên cứu này.

4.2.6. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA

Để xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho một phản ứng ELISA, chúng tôi sẽ tiến hành nghiền 0,2 g lá cây bị bệnh tristeza trong 1,2 ml đệm tách chiết, ly tâm thu dịch sau đó pha loãng dịch ban đầu ở các nồng độ pha loãng 2, 4, 8, 16 và 32 lần. 200 µl dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau được sử dụng để thử nghiệm kỹ thuật ELISA. Kết quả của phản ứng ELISA được thể hiện trong hình 4.7 như sau:

Hình 4.7. Kết quả nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA a. Bước ủ mẫu phân tích; b. Kết quả sau khi ủ cơ chất

Kết quả nghiên cứu thể hiện trong hình 4.7 cho thấy: khi nồng độ dung dịch mẫu càng thấp, cường độ tín hiệu màu của kỹ thuật ELISA càng thấp. Ở độ pha loãng 16 lần (giếng 1G và 2G) và 32 lần (giếng 1H và 2H), cường độ tính hiệu màu ở giếng phân tích không có sự sai khác so với cường độ tín hiệu màu ở giếng kiểm chứng âm tính (giếng 1B và 2B). Điều này chứng tỏ ở các nồng độ pha loãng 16 lần trở lên, hàm lượng kháng nguyên của virus tristeza không đủ để cho phép phát hiện được mẫu dương tính bằng kỹ thuật ELISA trong nghiên cứu này. Như vậy, kỹ thuật ELISA được phát triển trong nghiên cứu này chỉ phát hiện được bệnh tristeza ở độ pha loãng mẫu 8 lần trở lên.

Từ những kết quả phân tích trên, chúng tôi xây dựng được quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện tristeza như sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu:

- Lấy 0,2 g mẫu lá cam, quýt, cắt nhỏ và cho vào ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 2 viên bi inox và 1.200 µl dung dịch đệm tách chiết. Đặt eppendorf chứa mẫu vào máy đồng hóa, nghiềm mẫu 3 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây ở tốc độ 4.000 vòng/phút để thu được dung dịch đồng nhất.

- Ly tâm mẫu ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút, ở nhiệt độ 10oC. - Dùng micropipet chuyển phần dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

Bước 2: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu:

- Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v).

- Bổ sung 200 µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu đã được pha loãng vào mỗi giếng. - Ủ ở 37oC trong 2h. Để cố định kháng thể vào giếng

- Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm rửa (Washing buffer) ở nhiệt độ phòng, mỗi lần ngâm 3 phút. Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong các giếng.

Bước 3: Bổ sung mẫu phân tích:

- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch mẫu phân tích. - Ủ 4h ở 37oC.

Bước 4: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) của hãng Agritest trong dung dịch đệm cộng hợp (Conjugate buffer) (hàm lượng BSA trong đệm là 4g/lít) theo tỷ lệ 1:500 (v/v).

- Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp. - Ủ 2h ở 37oC hoặc qua đêm ở 4 oC.

Bước 4: Bổ sung cơ chất:

- Pha loãng cơ chất p-nitrophenil phosphate (Merck) trong dung dịch đệm cơ chất (Substrate buffer) theo tỷ lệ 1/10 (m/v).

- Bổ sung 200 µl cơ chất vào giếng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng ở nơi tránh ánh sáng 3h cho đến khi hiển thị màu rõ ràng có thể phát hiện bằng mắt thường.

Bước 5: Kiểm tra và đọc kết quả

Quan sát tín hiệu màu hình thành ở các giếng. Kết quả chỉ được xác định trong trường hợp mẫu kiểm chứng dương tính có cường độ màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính. Các mẫu cho tín hiệu màu cao hơn so với mẫu kiểm chứng âm tính được xác định là mẫu nhiễm virus gây bệnh tristeza trên cây có múi. Các mẫu có tín hiệu màu thấp hơn hoặc bằng tín hiệu màu của mẫu kiểm chứng âm tính được xác định là mẫu âm tính với virus gây bệnh tristeza.

Quy trình kỹ thuật ELISA có giới hạn phát hiện là nồng độ mẫu được pha loãng 8 lần.

4.3. Kết quả thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện bệnh Tristeza trên các mẫu thu thập các mẫu thu thập

Với quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện virus gây bệnh tristeza trên cây có múi được đã xây dựng, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 20 mẫu cây có múi gồm 10 có kiểu hình bị bệnh tristeza và 10 mẫu có kiểu hình không bị bệnh tristeza. Kết quả thử nghiệm được tổng hợp trong hình 4.8 và bảng 4.2 dưới đây:

Hình 4.8. Kết quả thử nghiệm quy trình ELISA phát hiện bệnh tristeza trên các mẫu thu thập. I. Kết quả phản ứng ELISA; II. Ghi chú thứ tự bổ sung

Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm quy trình ELISA phát hiện bệnh tristeza trên các mẫu thu thập

STT Ký hiệu mẫu Kết quả phát hiện bằng ELISA

Đặc điểm biểu hiện bệnh 1 CBH -1 Bị bệnh Không bị bệnh 2 CBH -2 Không bị bệnh Không bị bệnh 3 CS1-1 Không bị bệnh Không bị bệnh 4 CS2-1 Không bị bệnh Không bị bệnh 5 CS4-1 Không bị bệnh Không bị bệnh 6 CS5-1 Bị bệnh Không bị bệnh 7 CS0-1 Không bị bệnh Không bị bệnh 8 CC1 Không bị bệnh Không bị bệnh 9 CC2 Không bị bệnh Không bị bệnh 10 QN4 Không bị bệnh Không bị bệnh 11 V2-1 Bị bệnh Bị bệnh 12 V2-2 Bị bệnh Bị bệnh 13 V2-3 Bị bệnh Bị bệnh 14 V2-4 Bị bệnh Bị bệnh 15 V2-5 Bị bệnh Bị bệnh 16 V2-6 Không bị bệnh Bị bệnh 17 V2-7 Bị bệnh Bị bệnh 18 V2-8 Bị bệnh Bị bệnh 19 V2-9 Bị bệnh Bị bệnh 20 V2-10 Bị bệnh Bị bệnh

Kết quả phân tích ELISA trên hình 4.8 và được tổng hợp trong bảng 4.2 cho thấy: Trong số 10 mẫu cam, quýt có kiểu hình bị bệnh tristeza, kỹ thuật ELISA phát hiện đúng được 9 mẫu (chiếm tỷ lệ 90%) và 1 mẫu cho kết quả

âm tính, chiếm tỷ lệ 10%. Như vậy, kỹ thuật ELISA phát triển trong nghiên cứu này có 9/10 mẫu dương tính thật và 01 mẫu âm tính giả.

Trong số 10 mẫu có kiểu hình không bị bệnh, kỹ thuật ELISA phát hiện đúng 8 mẫu (chiếm tỷ lệ 80%) và có 2 mẫu cho kết quả dương tính, chiếm tỷ lệ 20%. Như vậy, kỹ thuật ELISA phát hiện được 8/10 mẫu âm tính thật và 02 dương tính giả.

Từ kết quả thử nghiệm trên, chúng tôi xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA so với kết quả phân tích kiểu hình lần lượt là 90% và 80%.

Phần 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

1. Đã thu thập được 20 mẫu cam, quýt phục vụ cho nghiên cứu trong đó có 10 mẫu có kiểu hình bị bệnh và 10 mẫu có kiểu hình không bị bệnh tristeza.

2. Đã xây dựng được quy trình kỹ thuật ELISA phát hiện virus gây bệnh tristeza trên cây có múi. Quy trình có giới hạn phát hiện là sử dụng 200 µl mẫu có độ pha loãng 8 lần.

3. Đã thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA trên 20 mẫu cam quýt. Kết quả thử nghiệm cho thấy, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA lần lượt là 90% và 80% so với kết quả phân tích kiểu hình.

5.2. Kiến nghị

Do thời gian có hạn, đề tài còn nhiều nội dung cần tiếp tục nghiên cứu:

-Cần xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật ELISA theo nồng độ của kháng nguyên virus trong mẫu phân tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Cần thử nghiệm kỹ thuật ELISA với số lượng mẫu lớn hơn để xác định chính xác độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật so với kết quả phân tích kiểu hình.

TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt

1. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (2020), Tổng diện tích cây ăn quả phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt.

2. Nguyễn Minh Châu (2012). Quản lý tổng hợp bệnh vàng lá greening trên cây có múi ớ các tỉnh phía Nam Việt Nam,Bệnh virus hại thực vật ở Việt Nam 2: 264-277.

3. Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn quả nhiệt đới, tập (1), Nxb. Nông Thôn.

4. La Việt Hồng, Chu Hoàng Hà, Đặng Thị Hương, Lâm Đại Nhân (2011), Nghiên cứu cấu trúc di truyền của một số dòng citrus tristeza gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP Hà Nội 2, 16: 117-126, Hà Nội.

5. Hoàng Thị Thủy (2015). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số biện pháp kỹ thuật đối với nguồn thực liệu tạo quả không hạt cây có múi. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp.

6. Hà Minh Trung (2006), Hoàn thiện công nghệ sản xuất cây có mùi đặc (cam, quýt, bưởi) sạch bệnh greening và các bệnh virus khác ở các tính phía Bắc, Kỷ yếu Hội nghị tổng kết khoa học và công nghệ nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 190- 205.

7. Hoàng Văn (1/2021), Cây ăn quả có múi mang lại giá trị kinh tế cao, Tạp chí Kinh tế nông thôn.

II. Tiếng Anh

8. Ahmad M. H., A. R. J. Eaglesham A.R.J., and Hassouna S. (1981). Examining serological diversity of “cowpea” rhizobia by the ELISA technique. Archives of Microbiology 130: 281–287.

9. Aulbach A.D., and Amuzie C.J. (2017). Chapter One - Calcium and Bone Metabolism Indices. Advances in Clinical Chemistry 82: 1-46.

10. Bar-Joseph M., Garnsey S.M., Gonsalves D., Moscovitz M., Punrcifull D.E., Clark M.F. và Loebenstein G. (1979). The use of Enzyme – linked

Immunosorrbenrt assay for detection of citrus tristeza virus .

Phytopathology 69: 190-194.

11. Berk Z. (2016). Diseases and pests. In Citrus Fruit Processing, Academic Press. 83-93.

12. Borah M., Nath P.D. và Saikia A.K. (2014). Biologycal and serological techniques for detection of citrus tristeza virus affecting Citrus species of Assam, India. African Journal of Agricultural Research 9 (52): 3804-3810.

13. Cambra M., Goriris M.T., Marroquin C., Roman M.P. Olmos A.O., Martinez M.C., Hermoso de Mendoza A. Lopez A. and Navarro L. (2000). Incidence and epidemiology of Citrus tristeza virus in the Valencian Community of Spain.

Virus Research 71 (1–2): 85-95.

14. Castillo J., Martí M.R., Gowda S., Hilf E.M., Garnsey S.M., and Dawson W.O. (1997). Kinetics of Accumulation of Citrus Tristeza Virus RNAs.

Virology 228 (1): 92-97.

15. Cheng C.M., Martinez A.W., Jinlong Gong, Mace C.R., Phillips S.T., Carrilho E., Mirica K.A., Whitesides G.M. (2010). Paper-Based ELISA. Angewandte Chemie 49 (28): 4771-4774.

16. Domínguez A., Guerri J., Cambra M., Navarro L., Moreno P., and Peña L. (2000). Efficient production of transgenic citrus plants expressing the coat protein gene of citrus tristeza virus. Plant Cell Reports 19: 427–433.

17. Gmitter F.G., and Hu X. (1990). The possible role of Yunnan, China, in the origin of contemporary citrus species (Rutaceae). Economic Botany 44: 267–277.

18. Gutherie H. and Picciano M. (1995). Human nutrition. St Louis, MO, USA, Mosby.

19. Knight A.R., Taylor E.L., Lukaszewski R., Jensen K.T., Jones H.E., Carré J.E., Isupov M.N., Littlechild J.A. (2018). A high-sensitivity electrochemiluminescence-based ELISA for the measurement of the oxidative stress biomarker, 3-nitrotyrosine, in human blood serum and cells. Free Radical Biology and Medicine 120: 246-254.

20. Moreno P., Ambrós S., Albiach-Marti M.R., Guerri J., and Peña L. (1957). Tristeza virus of citrus: a pathogen that changed the course of the citrus industry.