CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết
Q trình điều chế các loại cao chiết đƣợc mơ tả theo hình 2.2.
Hình 2.3. Sơ đồ điều chế các cao chiết.
Nguyên liệu Thân cây Chùm ngây
Bột thân cây Chùm ngây 1. Xử lí, sấy khơ 2. Xay nhỏ thành bột
1. Khảo sát các chỉ tiêu hóa lí
2. Khảo sát thời gian chiết, lựa chọn phƣơng pháp chiết
3. Ngâm chiết kiệt với khối lƣợng lớn trong EtOH và cất loại dung môi dƣới áp suất thấp
Cao tổng EtOH
Cao n-hexan Đo hoạt tính sinh học 1. Chiết với dung mơi n-hexan
2. Cất loại dung môi dƣới áp suất thấp
1. Chiết với dung môi diclomethane 2. Cất loại dung môi dƣới áp suất thấp
1. Chiết với dung môi ethyl acetate 2. Cất loại dung môi dƣới áp suất thấp
1. Chiết với dung môi EtOH và nƣớc 2. Cất loại dung môi dƣới áp suất thấp
1. Đo GC-MS
2. Đo hoạt tính sinh học Cao EtOAc
Cao cuối Cao CH2Cl2
Điều chế cao tổng
Nguyên liệu là thân cây Chùm ngây sau khi thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khô rồi đem xay nhỏ thành bột. Thu 1000 gam bột để tiến hành chiết.
Lần 1: Cho 1000 gam bột nguyên liệu vào cốc thủy tinh loại lớn, cho 5 lít EtOH tuyệt đối vào cốc, bịt đầu bằng giấy bạc, ngâm khoảng 24 giờ. Dịch chiết đem cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu dịch đặc.
Lần 2: Cho dung dịch EtOH hồi lƣu vào bã nguyên liệu đã chiết lần 1 và thêm 1 lít EtOH tuyệt đối, bịt đầu bằng giấy bạc, ngâm khoảng 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu đƣợc dịch đặc.
Lần 3: Cho dung dịch EtOH hồi lƣu vào bã nguyên liệu đã chiết lần 2 và thêm 1 lít EtOH tuyệt đối, bịt đầu bằng giấy bạc, ngâm khoảng 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không thu đƣợc dịch đặc.
Lặp lại cho đến khi thấy dịch chiết sau khi cất loại dung mơi khơng cịn thu đƣợc cao nữa thì dừng lại. Tổng dung dịch EtOH tuyệt đối sử dụng là 9 lít.
Điều chế cao n-hexan, diclomethane, ethyl acetate, ethanol và cao nƣớc
Dồn dịch đặc tổng các lần chiết và cất loại dung môi bằng máy cô quay chân khơng để thu đƣợc cao, hịa tan cao trong nƣớc cất rồi tiến hành phân lớp lần lƣợt với các dung môi: n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, EtOH, và H2O.
Phân lớp với n-hexan, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL n-hexan. Tổng dịch chiết khoảng 400 mL, cất loại dung môi thu đƣợc cao n-hexan.
Phân lớp với diclomethane, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL CH2Cl2. Tổng dịch chiết khoảng 300 mL, cất loại dung môi thu đƣợc cao CH2Cl2.
Phân lớp với ethyl acetate, chiết 3 lần, với khoảng 500 mL CH3COOC2H5. Tổng dịch chiết khoảng 400 mL, cất loại dung môi thu đƣợc cao EtOAc.
Phân lớp với ethanol, chiết 3 lần, hòa tan một lƣợng tối thiểu vào C2H5OH.Sau đó, cho vào một ít nƣớc. Phần cịn lại khơng hịa tan trong các dung mơi là dịch nƣớc.
Hình 2.4. Q trình chiết phân đoạn qua các dung mơi.
Hình 2.5. Các cao chiết từ các dung môi
n-hexan, diclomethane, ethyl acetate, ethanol và nƣớc. 2.2.5. Thử hoạt tính sinh học cao n-hexan và cao cuối
Phân đoạn dịch chiết n-hexan và ethanol đƣợc xác định hoạt tính chống oxy hóa qt gốc tự do DPPH; hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và thử tác dụng ức chế tế bào ung thƣ trên dòng tế bào ung thƣ gan tại Phòng thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.5.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết thân cây Chùm ngây để nghiên cứu hoạt tính sinh học
Trong phạm vi của đề tài, tôi lựa chọn cao phân đoạn của dịch chiết n-hexan từ cao tổng ethanol để thử hoạt tính chống oxy hóa và kháng vi sinh vật kiểm định và cao phân đoạn của dịch chiết ethanol từ cao cuối để thử hoạt tính chống oxy hóa và thử tác dụng ức chế tế bào ung thƣ gan.
2.2.5.2. Phương pháp đánh giá hoạt t nh qu t gốc tự do PPH Nguyên lý
1,1- Diphenyl 1-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2- Diphenyl-1-1picryhydrazine (DPPH-H) có màu vàng. Đo độ giảm hấp thụ ở bƣớc sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa[16].
DPPH màu tím + RH DPPH-H + R
Các bước tiến hành
Mẫu thử đƣợc pha trong DMSO. DPPH pha loãng trong MeOH với nồng độ thích hợp. 10 μL mẫu thử đƣợc ủ với 190 μL dung dịch DPPH, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phút và đo trên máy ELISA ở bƣớc sóng 517 nm. Chất đối chứng Ascorbic đƣợc dùng để kiểm sốt độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tƣơng đƣơng [1, 2]. Các phép thử đƣợc lặp lại 3 lần.
Kết quả đƣợc tính theo cơng thức sau:
- : Mật độ quang trung bình của mẫu thử
- : Mật độ quang trung bình của mẫu control (khơng có mẫu thử, chỉ có DPPH, coi nhƣ giá trị ức chế 0%).
2.2.5.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế ATCC: 3 chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella. enterica ATCC12228), 3 chủng Gram + (Enterococcuc. faecalis
ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC
13245), 1 chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 đƣợc cung cấp bởi
viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia[17].
Các bước tiến hành
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ [3]. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu ban đầu đƣợc pha
loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần: 256µg/ml, 128µg/ml, 64µg/ml, 32µg/ml, 16µg/ml, 8µg/ml, 4µg/ml và 2µg/ml với số thí nghiệm lặp lại N=3.
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×104CFU/ml
Tiến hành thử: lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mg/ml vào hàng đầu tiên có chứa 100l mơi trƣờng LB rồi pha lỗng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt đƣợc nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và đƣợc xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn. Nistatin và cyclohexamide cho nấm.
2.2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tế bào Nguyên lý
Phƣơng pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phƣơng pháp so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT. MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 570nm[18].
Chuẩn bị các dòng tế bào
Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc cung cấp bởi GS. Jeong-Hyung Lee, trƣờng ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc. Tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy in vitro theo phƣơng
pháp Mosmann và cs [3]. Các dịng tế bào ni cấy ở 37oC trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phơi bị 10% (FBS), 100U/ml penicillin và 100mcg/ml streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 48 giờ.
Các bước tiến hành:
Tế bào đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100µg/mL). Sau đó chúng đƣợc ni cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24 giờ, chúng đƣợc thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Sau 72h, cho phản ứng
với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết mơi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Camptothecin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo cơng thức:
[
]
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức:
√ ∑ ̅
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i x : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc tiếp theo hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.