Nhiều báo cáo cho thấy các tế bào cĩ thể tự liên kết với nhau để tạo thành các lớp dày gồm nhiều tế bào, các lớp này được gọi là "tấm tế bào" và tấm tế bào này cĩ thể được chế tạo theo một số phương pháp khác nhau. Green và CS là nhĩm nghiên cứu đầu tiên báo cáo thành cơng trong việc nhân khối các tế bào sừng người thơng qua sự hỗ trợ của lớp tế bào nuơi [135] và thu nhận các tế bào gắn kết với nhau này bằng enzyme dispase, để tách tấm tế bào này bằng cách phá hủy một số protein chất nền ngoại bào nhưng khơng phải là các protein dùng để liên kết tế bào [63]. Tấm tế bào được tạo ra theo phương pháp này đã được chứng minh trên lâm sàng như một phương pháp điều trị cho các vết bỏng sâu và diện rộng ở da [110]. Những nghiên cứu về tấm tế bào với màng ối cũng đã được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực nhãn khoa [146], [152]. Trong trường hợp này, màng ối đĩng vai trị như một giá thể để mang các tế bào biểu mơ để tạo thành tấm tế bào trong đĩa nuơi cấy để điều trị các bệnh lý cĩ liên quan giác mạc.
Hai phương pháp này được sử dụng chủ yếu để tạo ra tấm tế bào để tái tạo các tổn thương hoặc bệnh lý cĩ liên quan đến bề mặt biểu mơ. Ngồi ra, một nhĩm nghiên cứu khác đã nghiên cứu tạo ra tấm tế bào mà khơng cần sử dụng các enzyme hoặc các cell scraper để thu tế bào mà thay vào đĩ sử dung phương pháp giảm nhiệt độ để thu tế bào [23], [94].
cơng với nhiều loại tế bào khác nhau: tế bào biểu mơ [23], [119], tế bào khơng phải biểu mơ [14], tế bào gốc và các tế bào gốc đa tiềm năng [68], [80], [113]. Những kết quả mà cơng nghệ tạo tấm tế bào tạo ra cĩ thể gợi mở về một hướng nghiên cứu mới trong tương lai để tạo ra các mơ hoặc các cơ quan khi kết hợp với các cơng nghệ tiên tiến khác
Trong các báo cáo gần đây, việc thu nhận tấm tế bào cũng cĩ thể được thực hiện bởi các kích thích bên ngồi như dựa vào lực từ trường [76], [168], sự phân cực điện hĩa [67], giảm độ pH [66], dung dịch ion và ánh sáng [75], [92]. Các kết quả nghiên cứu này đều dựa trên một cơ chế chung, theo đĩ một kích thích bên ngồi gây nên sự thay đổi trên bề mặt chai nuơi cấy làm tách rời các tế bào nuơi cấy khỏi chai nuơi. Như vậy, sử dụng hợp lý cơng nghệ tạo tấm tế bào cĩ thể đĩng một vai trị quan trọng để tạo ra các sản phẩm tế bào phục vụ cho ngành y học tái tạo.
1.6. Kỹ thuật nuơi cấy tế bào 1.6.1. Nuơi cấy sơ cấp
Là phương pháp sử dụng các tế bào sau khi được tách từ các mảnh mơ và trước lần cấy chuyền đầu tiên. Quy trình được tiến hành bắt đầu từ lúc thu nhận các mẫu sinh thiết, các mảnh mơ sống. Sau đĩ, các mảnh mơ được xử lí sơ bộ để loại bỏ vi khuẩn, nấm cũng như các yếu tố khơng mong muốn khác. Sau đĩ, sẽ được tách thành dạng huyền phù với các tế bào đơn lẻ trước khi cho vào tủ nuơi tế bào [55]. Cĩ nhiều phương pháp để tách rời các tế bào thành dạng huyền phù nhưng khơng gây tổn thương đáng kể cho tế bào. Các tế bào trong khối mơ liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với chất nền ngoại bào nhờ các cầu nối protein hình thành giữa các tế bào với nhau. Để tách rời các tế bào khỏi khối mơ người ta thường dùng các tác động cơ học bẻ gãy những cầu nối hoặc/và dùng các enzyme để phân hủy các cầu nối trên. Tác động cơ học được thực hiện bằng cách cắt nhuyễn mơ, sau đĩ huyền phù trong dung dịch PBS và để lắng rồi thu dịch trong, dịch đĩ cĩ chứa tế bào đơn. Phương pháp này cho hiệu quả khơng cao, số lượng tế bào đơn thu nhận ít, vì vậy, thường áp dụng cho những mẫu mơ cĩ kích thước lớn và khơng khan hiếm. Tuy nhiên, việc tách bằng phương pháp cơ học sẽ thu được những tế bào cĩ khả năng sống cao. Trong phương
pháp tách tế bào bằng enzyme, các protease được sử dụng là những enzyme thủy phân protein như trypsine, collagenase, elactase, pronase, dispase hay một tổ hợp các enzyme khác nhau. Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mơ thường dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mơ với enzyme sau đĩ sẽ sử dụng enzyme để thu nhận được lượng tế bào tối đa [54].
1.6.2. Nuơi cấy thứ cấp
Được tiến hành sau khi tế bào được tạo dịng từ nuơi sơ cấp. Vì hầu hết các tế bào sau khi nuơi cấy sẽ được bảo quản đơng lạnh nên việc nuơi cấy thứ cấp được bắt đầu bằng việc giải đơng và nuơi cấy trong các mơi trường thích hợp.
1.7. Mơ hình động vật trong đánh giá vật liệu ghép1.7.1. Tiêu chuẩn lựa chọn các mơ hình động vật 1.7.1. Tiêu chuẩn lựa chọn các mơ hình động vật
Khi quyết định chọn lựa các lồi động vật cho một mơ hình thực nghiệm cụ thể cĩ một số tiêu chí cần được xem xét. Cần phải cĩ một thiết kế nghiên cứu hồn chỉnh trước khi lựa chọn các lồi động vật để sử dụng làm nghiên cứu. Theo như tác giả Schimandle và Boden [137] các tiêu chí để lựa chọn động vật thí nghiệm bao gồm: giá cả và điều kiện chăm sĩc, tính sẵn cĩ, sự chấp thuận của xã hội, khả năng của các lồi động vật sống được trong điều kiện nuơi nhốt và làm vệ sinh một cách dễ dàng. Các điều kiện nuơi nhốt và sử dụng động vật được kiểm sốt bởi Đạo luật Bảo vệ Động vật (Federal Animal Protection Act) áp dụng trong các nghiên cứu khoa học và các tiêu chí kiểm sốt cĩ thể thay đổi khác nhau giữa các quốc gia.
Các yêu cầu tối thiểu để sử dụng động vật trong nghiên cứu khoa học cần cĩ là các điều kiện nuơi dưỡng và chăm sĩc như kích thước chuồng trại, điều kiện ánh sáng, vệ sinh sàn nhà … và cần phải tuân thủ quy trình chăm sĩc khi tiến hành một nghiên cứu trên động vật. Các đặc điểm cụ thể sẽ thay đổi tùy theo từng lồi. Các tiêu chí khác bao gồm chi phí thấp để duy trì việc chăm sĩc, dễ dàng thao tác, khả năng chống nhiễm trùng và bệnh tật, tính đồng nhất giữa các động vật, đặc điểm sinh học tương tự như con người, dễ dàng phẫu thuật, sự tiện nghi và nhân viên hỗ trợ với một cơ sở dữ liệu về thơng tin sinh học đầy đủ cho các lồi. Ngồi ra, tuổi thọ của các lồi được
chọn phải phù hợp với thời gian nghiên cứu. Cụ thể hơn, đối với các nghiên cứu đánh giá sự tương tác giữa vật liệu – mơ sụn (chẳng hạn như cấu trúc vi mơ và thành phần của sụn) cũng như mơ hình ghép sụn và các đặc tính tái tạo sụn, điều này rất quan trọng vì các kết quả sau đĩ dùng để ngoại suy cho các trường hợp thực nghiệm trên người. Cuối cùng kích thước của động vật phải được xem xét để đảm bảo rằng phù hợp với số lượng và kích thước của mảnh ghép được lựa chọn [138]. Theo tác giả Hazzard và CS nhận xét rằng trong một lĩnh vực nghiên cứu, khơng cĩ mơ hình động vật duy nhất nào phù hợp cho tất cả các mục đích nghiên cứu, cũng như khơng cĩ một mơ hình động vật nào bị bỏ đi vì khơng phù hợp cho tất cả các mục đích nghiên cứu. Do đĩ, nhiều hệ thống mơ hình thực nghiệm là cần thiết để thiết lập một mơ hình nghiên cứu đa dạng phù hợp cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau [70].
Riêng đối với lĩnh vực cơng nghệ mơ sụn, khi lựa chọn một mơ hình động vật ngồi việc tuân thủ các tiêu chuẩn chung để lựa chọn một lồi động vật phù hợp thì cần phải xem xét đến các tiêu chí cĩ liên quan đến tế bào cần cấy ghép, giá thể ghép và các yếu tố hoạt hĩa sinh học hỗ trợ sử dụng để nuơi cấy tế bào. Kích cỡ trung bình của các khiếm khuyết sụn của người là khoảng 550 mm3, và tổn thương sụn của người địi hỏi điều trị thường cĩ đường kính từ 10 mm trở lên [34]. Các mơ hình động vật gặm nhấm, động vật lưỡng cư và động vật nhỏ cĩ chi phí hiệu quả, dễ sử dụng và hữu ích cho các nghiên cứu thí điểm và nghiên cứu bằng chứng. Chuột và thỏ cĩ sẵn nên được sử dụng nhiều cho nghiên cứu thực nghiệm in vivo để đánh giá tiềm năng sửa chữa sụn của tế bào và mơ người. Các mơ hình động vật lớn với sụn khớp cứng hơn cho phép nghiên cứu cả độ dày từng phần và sửa chữa tồn bộ bề dày của sụn cũng như sửa chữa xương dưới sụn. Độ dày khớp và độ dày lớp sụn cho mơ hình chĩ, mèo và lợn nhỏ vẫn nhỏ hơn đáng kể so với con người. Việc sửa chữa và phục hồi các khiếm khuyết sụn và xương cĩ kích thước và thể tích tương đương với tổn thương của con người cĩ ý nghĩa lâm sàng cĩ thể được nghiên cứu trên mơ hình ngựa cho kết quả đáng tin cậy hơn. Đối với các mơ hình động vật lớn hơn cĩ thể gần tương đồng với tình trạng lâm sàng ở người, nhưng chúng cĩ những bất lợi về tài chính, chăm sĩc, theo dõi sau mổ ghép và thu nhận mảnh ghép sau đĩ rắc rối về mặt y đức hơn [34].
Thỏ là một trong những lồi động vật thường được sử dụng cho nhiều nghiên cứu y học đặc biệt là trong lĩnh vực xương khớp. Đĩ là do thỏ cĩ những thuận lợi nhất định trong việc xử lý và thao tác vì chúng cĩ khớp lớn hơn và cĩ kích thước tốt để dễ dàng tiến hành phẫu thuật và xử lý mẫu. Thỏ cĩ độ dày sụn khớp từ 0,25 mm-0,75 mm, và cĩ kích thước cơ thể thuận tiện cho việc phẫu thuật ghép và chăm sĩc sau ghép. Ngồi ra, cơ thể thỏ đạt đến sự trưởng thành của mơ sụn xương trong thời gian ngắn vào khoảng 6 tháng tuổi, điều này rất phù hợp để triển khai các nghiên cứu liên quan về xương khớp do khơng phải chờ đợi lâu để thu thập kết quả. Thỏ đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng sửa chữa sụn trong các nghiên cứu kéo dài đến 16 tuần, mặc dù một số nghiên cứu trên thỏ kéo dài 1 năm đã được thực hiện [60], [99].
So với các lồi khác, chẳng hạn như các lồi linh trưởng và một số động vật gặm nhấm, ở thỏ cĩ sự thay đổi và đổi mới của mơ sụn nhanh hơn. Điều này cĩ thể gây ra các khĩ khăn để ngoại suy kết quả từ các nghiên cứu thực nghiệm trên thỏ để áp dụng các kết quả nghiên cứu trên người. Tuy nhiên, thỏ thường được sử dụng để sàng lọc vật liệu cấy ghép trước khi thử nghiệm trên mơ hình động vật lớn hơn.
Tĩm lại, rõ ràng là mỗi lồi động vật đều cĩ những ưu điểm, nhược điểm riêng của chúng để sử dụng phù hợp trên các mơ hình thực nghiệm. Thỏ là một mơ hình động vật được sử dụng phổ biến để chứng minh sự đáp ứng của mơ xương với vật liệu cấy ghép do các đặc điểm nổi bật của chúng như được sự đồng thuận của xã hội, chấp nhận về mặt y đức, tính kinh tế cũng như khả năng lây truyền bệnh từ động vật sang người là tương đối thấp ... Ngồi ra, đặc tính lành thương nhanh cũng là một ưu điểm làm cho chúng trở thành đối tượng sử dụng phổ biến trong các mơ hình động vật.
1.8. Các phương pháp đánh giá quá trình lành thương của mơ sụn
Sụn tồn tại trong nhiều hình dạng và kích cỡ khác nhau, hiện tại chưa cĩ tiêu chuẩn nào được thiết lập để đánh giá quá trình phục hồi của mơ sụn. Trong các nghiên cứu trên mơ hình động vật thì chụp X quang khơng cĩ giá trị trong theo dõi và đánh giá phục hồi mơ sụn mà chủ yếu dựa vào quan sát hình ảnh đại thể và kết quả phân tích đánh giá mơ học.
Bảng 1.1. Cơng cụ đánh giá sửa chữa sụn của Hiệp hội sửa chữa sụn quốc tế (ICRS). Cơng cụ này được sử dụng bởi các bác sĩ phẫu thuật để đánh giá sự quan sát
đại thể của mơ sụn sửa chữa sau các can thiệp như ACI, khoan dưới sụn và nội soi kích thích tạo tổn thương dưới sụn (microfracture).
Tiêu chí đánh giá Điểm
Mức độ lắp Vùng tổn thương phục hồi bằng với vùng sụn xung 4 đầy vùng tổn quanh
thương so với Lắp đầy 75% độ sâu của vùng tổn thương 3 vùng sụn xung Lắp đầy 50% độ sâu của vùng tổn thương 2 quanh Lắp đầy 25% độ sâu của vùng tổn thương 1 Lắp đầy 0% độ sâu của vùng tổn thương 0 Mảnh ghép Mảnh ghép và mơ sụn xung quanh dính sát hồn tồn 4 dính vào mơ Mảnh ghép và mơ sụn xung quanh tách nhau < 1mm 3 chủ 3/4 chu vi mảnh ghép dính sát, 1/4 chu vi tách nhau > 2
1mm
1/2 chu vi mảnh ghép dính sát, 1/2 chu vi tách nhau > 1 1mm
Dưới 1/4 chu vi mảnh ghép dính sát với mơ chủ 0
Hình ảnh đại Bề mặt nhẵn mịn 4
thể Bề mặt cĩ hiện diện mơ sợi 3
Các vết nứt hoặc vết nứt nhỏ, rải rác 2 Nhiều, nhỏ hoặc ít nhưng khe nứt lớn 1 Thối hĩa tồn bộ diện tích ghép 0
Tổng điểm Độ 1: bình thường 12
Độ 2: gần như bình thường 11 – 8
Độ 3: bất thường 7 – 4
Độ 4: bất thường nghiêm trọng 3 – 1
“Nguồn: Van den Borne, M. P. J., et al, 2007” [157]
Tĩm lại, sự lựa chọn một mơ hình thử nghiệm trên động vật phù hợp là điều kiện tiên quyết để cĩ được một kết quả nghiên cứu hồn chỉnh và cĩ thể triển khai trên lâm
sàng. Đánh giá một cách đầy đủ các số liệu, các phân tích cụ thể trên các mơ hình động vật trước khi thực nghiệm là một bước khởi đầu rất quan trọng. Các thử nghiệm ban đầu phải được thực hiện trên một vài lồi động vật nhỏ để đánh giá tính khả thi của phương pháp thử nghiệm và kết quả cĩ tính lặp lại trước khi triển khai trên các mơ hình động vật lớn hơn. Cho dù là lựa chọn mơ hình động vật nào đi nữa, tất cả các kết quả thu được phải được hiểu đúng trong bối cảnh của mơ hình thử nghiệm sử dụng trên động vật nên chỉ cĩ thể sử dụng kết quả mang tính tham khảo khi tiến hành thực nghiệm trên người.
1.9. Các nghiên cứu liên quan
1.9.1. Tình hình nghiên cứu của nước ngồi
Thối hĩa khớp là một bệnh thối hĩa tiến triển, liên quan đến hệ thống tự miễn và phản ứng viêm. Ban đầu, những yếu tố cơ học làm xuất hiện các vết nứt hình sợi và các vi gãy xương do collagen bị suy yếu, từ đĩ sẽ gây ra sự hoạt hĩa và giải phĩng enzyme trong quá trình thối biến chất căn bản gây ra sự phá hủy sụn khớp và sự tạo khớp bị suy giảm. Kết quả là bề mặt sụn khớp bị mỏng dần, xơ hĩa và cĩ biểu hiện lâm sàng là đau và vận động khớp hạn chế. Mục tiêu điều trị chính là giảm sự hoạt hĩa và giải phĩng enzyme gây hủy bề mặt sụn khớp và giúp tái tạo lại bề mặt sụn khớp. Các phương pháp điều trị bằng thuốc hay phẫu thuật hiện nay cĩ thể làm giảm đau, giảm triệu chứng và kiểm sốt vơi hĩa [50], [53]. Tuy nhiên, những phương pháp điều trị bị hạn chế về hiệu quả và khơng ngăn chặn được quá trình tiến triển của bệnh, khả năng phục hồi lại chức năng bình thường của bề mặt sụn khĩ đạt được [139].
Nuơi cấy sụn đã được sử dụng để điều trị tổn thương sụn từ năm 1994. Sụn tự thân được tách chiết và nuơi cấy trước khi tiêm vào khớp, nuơi cấy sụn đã cung cấp một số kết quả tốt [57], [89]. Tuy nhiên, phương pháp này cũng cĩ một số hạn chế, đặc