Quần thể tế bào trong mơ mỡ cĩ nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm: hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu, TBGTM, tế bào mỡ. Trong đĩ, TBGTM, tế bào nội mơ, bạch cầu là những tế bào cĩ khả năng bám dính trên bề mặt nuơi plastic [48]. Do đĩ, những tế bào máu được loại bỏ và những tế bào ứng viên cho TBGTM sẽ được giữ lại sau khi nuơi trong mơi trường chọn lọc. Trong nghiên cứu của chúng tơi, kết quả sau 3 ngày nuơi cấy quần thể tế bào từ mơ mỡ cho thấy một lượng nhỏ các tế bào bám dính và trải thon dài trên bề mặt chai nuơi. Mơi trường nuơi cấy DMEM/F12 được sử dụng là mơi trường chọn lọc, kích thích sự tăng sinh và phát triển cho các TBGTM. Do đĩ, trong quá trình thay mơi trường và theo thời gian các tế bào khơng phải dịng TBGTM sẽ bị chết hoặc loại bỏ cơ học. Nên những ngày đầu chúng tơi thấy nhiều tế bào hình dạng trịn nhưng khoảng sau 6 ngày nuơi cấy thì số tế bào cĩ hình dạng trịn rất ít và xuất hiện những đám tế bào hình thoi cĩ xu hướng kết cụm lại với nhau. Sau 6 ngày nuơi cấy thì tế bào giống nguyên bào sợi tăng sinh chiếm khoảng 80% bề mặt chai nuơi. Sau cấy chuyền 2 lần thì tế bào cĩ sự đồng nhất về hình dạng cao. Qua đĩ, tế bào ứng viên cho TBGTM từ mơ mỡ thỏ đã được thu nhận trong nghiên cứu này.
Việc đánh giá đường cong tăng trưởng của TBGTM là một trong những nghiên cứu quan trọng để tính tốn thời gian thu nhận mơ mỡ, thời gian nuơi cấy, thời gian cấy chuyền của tế bào để phục vụ cho vấn đề ứng dụng ghép sau này. Tốc độ tăng trưởng của TBGTM từ mơ mỡ được đánh giá là nhanh hơn so với từ nguồn TBGTM được thu nhận từ tủy xương [93]. Trong nghiên cứu của chúng tơi thì thời gian để tăng trưởng đạt đỉnh đối với TBGTM từ mỡ thỏ là vào ngày thứ 6 và giảm dần tới ngày thứ 14. Đối với nguồn TBGTM từ mơ mỡ người thì tốc độ tăng trưởng chậm hơn so với thỏ, thường tế bào bắt đầu tăng sinh mạnh từ ngày 7 và đạt đỉnh vào ngày 14 [8]. Trong nghiên cứu của tác giả Zomer và cộng sự cũng cho thấy TBGTM từ mỡ thỏ tăng trưởng nhanh hơn so với nguồn thu nhận từ mỡ người và thời gian để số lượng tế bào tăng sinh gấp đơi mất 1,2 ± 0,7 ngày [180], kết quả này gần tương đồng với
nghiên cứu của chúng tơi khi số lượng tế bào ngày 2 ghi nhận được gấp 2,8 lần so với ban đầu.
Dựa vào hình thái tế bào cho thấy các TBGTM cĩ kiểu hình thái đặc trưng giống nhau như thon dài, bầu dục giống với hình hình thái của nguyên bào sợi. Đồng thời, hình dạng của các tế bào sau phân lập của nhĩm nghiên cứu tương đồng với hình dạng của TBGTM từ mơ mỡ thỏ được phân lập bởi Tirpáková và cộng sự (2021) (Hình 3.3D) [150].
Những nghiên cứu in vitro cho thấy sau khoảng 2 tuần cảm ứng biệt hĩa trong mơi trường biệt hĩa xương, sụn và mỡ, hình thái tế bào cĩ sự thay đổi. Trong mơi trường cảm ứng biệt hĩa mỡ thì các tế bào sẽ hình thành các giọt mỡ nội bào và sẽ bắt màu đỏ với thuốc nhuộm Oil Red [154]. Khi được cảm ứng tạo sụn, các tế bào trung mơ nuơi cấy biểu hiện các protein chất nền ngoại bào của sụn như collagen I, collagen X, aggrecan [182] sau 21 ngày được nuơi, các protein này bắt màu xanh đậm với thuốc nhuộm Alcian blue [22]. Khi được cảm ứng tạo xương, các tế bào biệt hĩa thành tế bào xương và cĩ thể tổng hợp chất nền ngoại bào xương và bắt màu với thuốc nhuộm Alizarin red. Trong nghiên cứu của chúng tơi, sự tích lũy các giọt mỡ nội bào, sự tổng hợp các protein chất nền ngoại bào xương và chất nền ngoại bào sụn ở TBGTM từ mơ mỡ được ghi nhận khi nuơi cấy trong mơi trường biệt hĩa tương ứng. Qua đĩ, quần thể tế bào thu nhận được cĩ thể biệt hĩa thành cả ba dịng tế bào thuộc dịng trung mơ.
Dựa vào tiềm năng biệt hĩa của TBGTM thì kết quả nghiên cứu của chúng tơi cũng hồn tồn phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới. Đơn cử như khi so sánh kết quả với nhĩm nghiên cứu của Tao-Chen Lee và Helena Debiazi Zomer [97], [180]. Trong nghiên cứu của 2 tác giả trên, nhĩm nghiên cứu cũng tiến hành thu nhận TBGTM từ mơ mỡ và sau đĩ cảm ứng biệt hĩa các TBGTM này thành các tế bào xương, sụn và mỡ. Kết quả biệt hĩa được đánh giá bằng các phương pháp nhuộm như Alirazin Red (đánh giá khả năng biệt hĩa tạo nguyên bào xương), Oil Red O (đánh giá khả năng biệt hĩa tạo mỡ) và Alcian Blue (đánh giá khả năng biệt hĩa tạo nguyên bào sụn). Kết quả được minh họa trong hình 4.1, các tác giả đã tiến hành biệt hĩa các TBGTM thành tế bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn.
Hình 4.1. Kết quả đánh giá tiềm năng biệt hĩa của TBGTM từ mơ mỡ thỏ của tác giả Helena Debiazi Zomer và Tao-Chen Lee
“Nguồn: Helena Debiazi Zomer et al, 2018 [180] và Tao-Chen Lee, 2014 [97]”
(A) , (B), (C) lần lượt là kết quả nhuộm Alirazin Red, Oil Red O và Alcian Blue
của tác giả Helena Debiazi Zomer. (D), (E), (F) lần lượt là kết quả nhuộm Alirazin Red, Oil Red O và Alcian Blue của tác giả Tao-Chen Lee.
Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội tế bào gốc, TBGTM biểu hiện dương tính với CD73, CD90, CD105, CD106, CD44 và âm tính với các dấu ấn của tế bào máu như CD34, CD45 [48]. Đối với TBGTM thu nhận từ mơ mỡ người thì biểu hiện của các dấu ấn bề mặt đã được đánh giá trong các nghiên cứu khác nhau [82], [84], các tế bào này cĩ biểu hiện CD29 +, CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, CD34− và CD45−. Tuy nhiên đối với TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ thì sự biểu hiện dấu ấn bề mặt cĩ một số khác biệt so với ở người. Các nghiên cứu so sánh kiểu hình của TBGTM thu nhận từ mỡ ở người và thỏ chỉ ra sự khác biệt trong biểu hiện của CD73, CD90 và CD105 [107], [153], [180].
Bảng 4.1. So sánh sự biểu hiện các dấu ấn đặc hiệu của TBGTM từ mỡ thỏ bằng phương pháp đo tế bào dịng chảy của các tác giả nước ngồi.
Phần trăm tế bào dương tính (%)
CD73 CD90 CD105 Zomer và cộng sự [180] 54 48 99,9 Martínez và cộng sự [107] 1,6 40,1 20,5 Tirpáková và cộng sự [150] 4,1 10,21 4,6
Tao Chen Lee và cộng sự [97]
0,73 1,48 1,14
Kết quả đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt của TBGTM thu nhận được từ mơ mỡ thỏ bằng phương pháp RT-PCR trong nghiên cứu của chúng tơi ghi nhận thấy gần tương đồng so với ở người, tuy nhiên dấu ấn CD90 khơng biểu hiện. Sự khác biệt này tương tự với nghiên cứu của Zomer và cộng sự [180] khi so sánh biểu hiện các dấu ấn của tế bào gốc giữa tế bào gốc thu nhận từ mơ mỡ thỏ so với thu nhận từ người bằng phương pháp phân tích flow cytometry. Kết quả ghi nhận cho thấy TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ và mỡ người đều khơng cĩ biểu hiện với CD34 và CD45 (<5% biểu hiện) và dương tính với CD105 (cả 99,9%), CD73 (54% so với 100%) và CD90 (48% so với 99,5 %), sự biểu hiện của CD73 và CD90 thấp hơn đáng kể trong tế bào thỏ so với tế bào người. Kết quả flow cytometry này tương đồng với tác giả Tirpáková [150], nhưng khi kiểm tra biểu hiện bằng RT-PCR thì nhận thấy cĩ biểu hiện với CD73, CD90 và CD105. Sự biểu hiện của các dấu ấn bề mặt cĩ thể bị ảnh hưởng bởi quá trình nuơi cấy trong ống nghiệm và số lần cấy chuyền ngày càng tăng. Bên cạnh đĩ, những nghiên cứu khác đã chứng minh sự biểu hiện các dấu ấn này khác nhau giữa các loại mơ và giữa các lồi khác nhau [96], [97], [150]. Đối chứng với các nghiên cứu khác, chúng tơi cĩ thể kết luận rằng quần thể tế bào thu nhận từ mơ mỡ thỏ trong nghiên cứu này cĩ
sự biểu hiện các dấu ấn đặc trưng cho TBGTM.
Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mơ mỡ đã phân lập được và nuơi cấy ở lần cấy chuyền thứ ba. Chúng tơi đã đánh giá các chỉ tiêu để xác định cho TBGTM, kết quả cho thấy các tế bào nuơi cấy đều là các tế bào bám dính trên chai nuơi, cĩ hình dạng thon dài đặc trưng cho TBGTM. Bên cạnh đĩ, quần thể tế bào này cĩ khả năng biệt hĩa được thành 3 dịng tế bào khác nhau thuộc nguồn gốc trung mơ đĩ là nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ với phương pháp xác định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào cĩ tiềm năng biệt hĩa được thành các dịng tế bào khác cũng như so sánh với các tác giả khác thấy kết quả nghiên cứu tương đối giống nhau. Tuy nhiên, biểu hiện dấu ấn bề mặt của TBGTM ở người và động vật là cĩ sự khác biệt và tới hiện tại cũng chưa cĩ sự thống nhất về tiêu chuẩn dấu ấn bề mặt TBGTM dành cho thỏ [48], [97], [159]. Do đĩ, chúng tơi cũng như nhiều tác giả nghiên cứu khác [41], [118], [123] cũng khơng sử dụng tiêu chí biểu hiện dấu ấn bề mặt để định danh TBGTM mà chỉ khảo sát thêm biểu hiện các dấu ấn sinh học.
Như vậy, với kết quả khảo sát khả năng bám dính, hình thái tế bào, tiềm năng biệt hĩa và biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của TBGTM cĩ thể kết luận rằng chúng tơi đã phân lập thành cơng TBGTM từ mơ mỡ thỏ. Đây là nguồn tế bào gốc rất quan trọng và đầy tiềm năng cho các ứng dụng cơ bản cũng như trên lâm sàng.
4.2. Tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc trung mơ mỡ thỏ và màng chân bì
4.2.1. Bàn luận kết quả khảo sát biểu hiện của các gien tạo sụn bằng qRT-PCR
Tất cả các gien khảo sát đều cĩ sự biểu hiện sau khi nuơi cấy trong mơi trường biệt hĩa sụn. Khi TBGTM được cảm ứng tạo sụn, chúng trải qua ba giai đoạn chính, bao gồm sự kết cụm tế bào, sự biệt hĩa thành tế bào sụn và sự trưởng thành [129]. Trong giai đoạn kết cụm, các tế bào liên kết và tương tác với nhau thơng qua các phân tử bám dính. Ngồi sự tăng cường biểu hiện của các phân tử liên kết tế bào, sự tổng hợp chất nền ngoại bào giàu collagen loại 2, collagen loại 1 và aggrecan được khởi động, gĩp phần tạo ra mạng lưới chất nền ngoại bào, hỗ trợ cho sự tăng sinh và biệt hĩa tế bào [43]. Để hoạt hĩa sự biểu hiện các protein chất nền ngoại bào trên,
được điều hịa tăng biểu hiện trong suốt quá trình biệt hĩa tạo sụn. Sự biểu hiện của
sox9 được xem như một dấu ấn cho sự biệt hĩa sụn sớm [46], ngồi ra sox9 cịn tham gia điều hịa một số gien khác trong quá trình trưởng thành sụn như làm giảm biểu hiện của runx2, colX liên quan tới sụn phì đại và làm tăng biểu hiện col2a1 trong sản xuất Collagen II [98], [170]. Trong nghiên cứu của chúng tơi ghi nhận được sự tăng biểu hiện cao nhất của sox9 từ ngày 7 so với kết quả của tác giả Đào Thị Thanh Thủy và cs [39] là ngày 21 và vào ngày thứ 14 trong nghiên cứu của tác giả Zhihua Lu và cs [103], điều khác biệt này cĩ thể liên quan đến nguồn tế bào thu nhận và số lần cấy chuyền. Sox9, col2a1 được biểu hiện trong nghiên cứu của chúng tơi từ ngày thứ 7 đến ngày 21 giống như trong kết quả của một số tác giả cĩ khảo sát về mức độ biểu hiện gien col2a1 và sox9 ở TBGTM thỏ được cảm ứng biệt hĩa sụn so với TBGTM khơng được cảm ứng [93], [103].
Sau giai đoạn kết cụm, các tế bào bắt đầu tăng sinh. Đồng thời, chất nền ngoại bào được sản xuất nhiều hơn và cĩ những thay đổi về thành phần như sự mất dần collagen I, sự tăng lên tenascin, matrilins, thrombospondins, collagen II, aggrecan. Điều này giúp cho tế bào tiền thân tạo sụn biệt hĩa hồn tồn thành tế bào sụn [72]. Kết quả đánh giá sự biểu hiện gien trong nghiên cứu này cho thấy rằng col1 biểu hiện mạnh nhất ở ngày 7 khi các tế bào bắt đầu co cụm lại thành dạng pellet và sau đĩ giảm dần đến ngày 21. Một số nghiên cứu khác đã chứng minh rằng sự biểu hiện của col1
được điều hịa bởi sự biểu hiện của runx2 [43], tuy nhiên kết quả của chúng tơi chưa cho thấy sự tương quan của runx2 và col1. Biểu hiện runx2 thì tăng từ mốc ngày thứ 7 và tới ngày 21. Sự tăng biểu hiện gien runx2 cũng được nhiều tác giả ghi nhận [118], [178].
Trong quá trình biệt hĩa tạo thành tế bào sụn trưởng thành, colX được coi như một protein chất nền ngoại bào đặc trưng [86]. Kết quả đánh giá sự biểu hiện gien của
colX cho thấy rằng sự biểu hiện này tăng dần theo thời gian và đạt mức cực đại ở ngày 21, tương đồng với một số tác giả khi ghi nhận sự gia tăng biểu hiện theo thời gian cảm ứng biệt hĩa sụn [39], [145]. Chiều hướng gia tăng sự biểu hiện này cũng được ghi nhận đối với gien acan, trong khi sự biểu hiện của col1 lại giảm dần.
cĩ thể thấy rằng TBGTM từ mơ mỡ đã cĩ những sự thay đổi đáng kể về sự biểu hiện một số gien đặc trưng trong quá trình trưởng thành sụn. Vào ngày thứ 7 sau khi cảm ứng thì cĩ sự biểu hiện cao đối với sox9, điều này gợi ý mạnh mẽ rằng TBGTM đang cĩ sự thay đổi theo chiều hướng khởi đầu cho quá trình tăng sinh, biệt hĩa thành nguyên bào sụn, tăng biểu hiện col2a1 gợi ý cho tế bào cĩ khả năng tiết chất nền đặc trưng cho sụn hyaline là colagen II. Aggrecan là proteoglycan chính của chất nền ngoại bào sụn cĩ thể chỉ ra một hoạt động biệt hĩa tạo sụn đang diễn ra mạnh mẽ, điều này phù hợp với sự biểu hiện của gien acan tăng dần và cao nhất vào ngày thứ 21. Runx2
và colX tăng biểu hiện gợi ý tế bào cĩ xu hướng bước qua giai đoạn phì đại [88]. Biểu hiện runx2 thường sớm và kéo dài hơn so với colX nên với kết quả của chúng tơi thì bắt đầu vào ngày thứ 14 gợi ý tế bào bắt đầu vào thời kỳ phì đại.
4.2.2. Bàn luận kết quả thu nhận màng chân bì
Sau khi xử lý cơ học và hĩa học để loại bỏ lớp thượng bì hồn tồn, phần tế bào thuộc mơ liên kết trong chân bì vẫn cịn rải rác. Một số cấu trúc mạch máu và thành phần phụ của da vẫn cịn hiện diện. Nhìn chung, thành phần collagen bên trong phần chân bì vẫn cịn giữ hình dạng giống như chưa xử lý, vẫn cịn độ dày đặc và liên kết chặt chẽ (hình 3.7 B và C).
Sau khi được khử trùng bằng tia gamma (hình 3.7 D và E) hồn tồn khơng cịn sự hiện diện các lớp tế bào ở phần thượng bì. Bên cạnh đĩ phần chất nền ở chân bì cĩ nhiều khoảng trống, giữa cấu trúc collagen cĩ nhiều lỗ hổng hơn tạo cấu trúc dạng xốp. Bên trong phần chân bì khơng cịn thấy sự hiện diện các tế bào thuộc mơ liên kết. Các cấu trúc mạch máu bị co rút khơng cịn thấy các nhân tế bào nội mơ và tế bào cơ. Các thành phần phụ khác của da cũng bị tiêu hủy, khơng cịn thấy nhân các tế bào cũng như khơng cịn hình ảnh cấu trúc ban đầu.
Giá thể màng chân bì thu nhận được đã đảm bảo loại bỏ được các yếu tố mạch máu, tế bào mơ liên kết, tế bào máu, chỉ cịn lại khung collagen. Kết quả thu nhận giá thể màng chân bì này cũng tương đồng với quy trình của tác giả Hồng Kc Hương và một số tác giả quốc tế như E. Roessner, và Penny Hogg [74], [136] (Hình 4.2).
nhau. Đây là đặc điểm lý tưởng để tế bào nuơi cấy cĩ thể bám dính, tăng trưởng và phát triển bên trong giá thể. Tất cả phần tế bào trong phần chân bì đã hồn tồn được