2.4.1. Quy trình phân lập, nuơi cấy và định danh TBGTM từ mơ mỡ thỏ
Sử dụng mơ mỡ thỏ, tiến hành phân lập nuơi cấy TBGTM. TBGTM từ mơ mỡ thỏ được thu nhận theo quy trình của tác giả Huỳnh Duy Thảo [9].
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Thỏ được chọn là các thỏ đực. Thỏ được chọn là những thỏ khỏe mạnh, 6 tháng tuổi, trọng lượng trung bình từ 2,0 – 2,5 kg.
2.4.1.1. Phân lập và nuơi cấy TBGTM từ mơ mỡ thỏ
Phương pháp phân lập và thu nhận TBGTM từ mơ mỡ thỏ:
- 30 phút trước khi tiến hành phẫu thuật lấy mơ mỡ, thỏ sẽ được tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lơng vùng da bụng thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật bằng betadine.
- Gây mê thỏ bằng Zoletil® 50 với liều 10 mg/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu. - Dùng dao phẫu thuật rạch da bụng, bĩc tách lấy mơ mỡ ở vùng dưới da.
- Khâu lại da bằng chỉ phẫu thuật, sát trùng lại vết khâu bằng betadine. Thỏ sau đĩ được chuyển về chuồng và chăm sĩc hậu phẫu.
- Mẫu mơ mỡ được cắt thành những mảnh nhỏ và ủ trong dung dịch enzyme Collagenase-Dispase ở nhiệt độ 37oC.
- Dịch tế bào được thu nhận và quay ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút. Thu phần cặn tế bào, bổ sung 5ml mơi trường nuơi DMEM/F12 cĩ bổ sung 10% FBS, huyền phù và lọc qua phễu lọc cĩ đường kính 70 µM.
- Dịch tế bào sau thu nhận được mang đi quay ly tâm 3000 vịng/phút trong 5 phút. Thu nhận cặn tế bào và huyền phù với mơi trường nuơi DMEM/F12 cĩ bổ sung 10% FBS. Chuyển dịch tế bào vào chai nuơi 25 cm2 nuơi ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
- Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer với thuốc nhuộm Trypan-blue để đánh giá mật độ tế bào.
- Sau 2 ngày nuơi cấy, thay mơi trường nuơi để loại bỏ các tế bào khơng bám dính. Mỗi chai nuơi tế bào sẽ được thay thế bằng 5 ml mơi trường nuơi mới gồm DMEM/F12 cĩ bổ sung 10% FBS. Các tế bào bám dính ban đầu cĩ dạng hình thoi, hiện diện dưới dạng từng tế bào riêng lẻ ở ngày thứ 2 - 3 khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược.
Phương pháp nhân khối tế bào:
- Khi tế bào tăng sinh kín khoảng 80% bề mặt chai nuơi, các tế bào được cấy chuyền sang chai nuơi mới
- Các tế bào bám dính sẽ được thu nhận bằng cách rửa chai nuơi với dung dịch PBS để loại bỏ mơi trường nuơi và ủ tế bào với 3ml dung dịch 0,25% (wt/vol) trypsin/0,02% (wt/vol) EDTA khoảng 3 phút trong tủ ủ ấm. Trung hịa enzyme với mơi trường nuơi cơ bản và thu tế bào bằng cách quay ly tâm với tốc độ 3000 vịng/phút trong 5 phút.
- Thu phần cặn lắng và huyền phù tế bào với mơi trường nuơi mới, chuyển tế bào này lên các chai nuơi mới với tỉ lệ 1:3, quan sát và theo dõi sự bám dính và tăng trưởng của tế bào dưới kính hiển vi đảo ngược.
- Thay mơi trường nuơi mới mỗi 3 ngày/lần. Việc nhân khối tế bào cĩ thể được tiến hành trong vịng 1 tuần với tỉ lệ 1:3 hoặc 1:4. Tế bào cĩ thể được cấy chuyền từ 3 – 8 lần để sử dụng cho các mục tiêu nghiên cứu in vitro.
2.4.1.2. Định danh TBGTM theo tiêu chuẩn của Hiệp Hội Liệu pháp Tế bào Quốc tế (ISCT)
Định danh TBGTM bằng 2 phương pháp kết hợp theo như thơng lệ quốc tế (ISCT) là:
Quan sát đặc tính bám dính của TBGTM (nhuộm Giemsa để quan sát hình thái tế bào).
Đánh giá khả năng biệt hĩa thành tế bào sụn, tế bào xương và tế bào mỡ trong điều kiện in vitro.
Đánh giá các dấu ấn chuyên biệt của TBGTM
Quan sát trực tiếp tế bào dưới kính hiển vi đảo ngược và nhuộm Giemsa để ghi nhận đặc tính bám dính vào giá thể của TBGTM.
Tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba được sử dụng để quan sát hình thái tế bào bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa.
Loại bỏ mơi trường nuơi và rửa lại 3 lần bằng dung dịch PBS lạnh.
Cố định tế bào trong dung dịch NBF 10% trong 45 phút.
Loại bỏ dung dịch cố định, rửa lại 3 lần với dung dịch PBS lạnh.
Tiến hành nhuộm tế bào với 2 ml thuốc nhuộm Giemsa trong vịng 2 phút, đợi 2 phút, bổ sung thêm 8 ml nước cất vào chai nuơi. Ủ trong 10 – 15 phút.
Loại bỏ thuốc nhuộm và rửa lại chai nuơi bằng nước cất cho sạch các vết thuốc nhuộm.
Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá hình thái tế bào, đánh giá khả năng bám dính của tế bào.
- Tiêu chí 2: Dựa vào tiềm năng biệt hĩa
+ Tiến hành biệt hĩa tạo xương bằng mơi trường StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco™) trong thời gian 14 ngày. Sau đĩ nhuộm Alizarin Red để đánh giá khả năng biệt hĩa thành nguyên bào xương in vitro.
Chỉ tiêu đánh giá: Tế bào dương tính khi chuyển dạng từ hình thái trung mơ sang hình thái đa diện, nhuộm với Alizarin Red thì chất nền xương bắt màu màu đỏ cam.
+ Tiến hành biệt hĩa tạo mỡ bằng mơi trường StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco™) trong thời gian 14 ngày. Nhuộm Oil red O để đánh giá khả năng tạo mỡ.
Chỉ tiêu đánh giá: Tế bào dương tính với Oil Red khi xuất hiện các giọt mỡ nằm bên trong bào tương tế bào bắt màu màu đỏ đậm.
Differentiation Kit (Gibco™) trong thời gian 14 ngày. Nhuộm Alcian blue để đánh giá khả năng tạo sun.
Chỉ tiêu đánh giá: Tế bào dương tính với Alcian blue khi trong chất nền xuất hiện màu xanh dương sáng màu, điều này chứng tỏ tế bào cĩ chức năng tổng hợp được các protein của chất nền ngoại bào sụn.
- Tiêu chí 3: Đánh giá các dấu ấn chuyên biệt của TBGTM
Các tế bào sau lần cấy chuyền thứ 3 sẽ được mang đi tách chiết RNA bằng Easy- Spin ™ (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc). Chúng tơi sử dụng RT-PCR để khuếch đại các DNA mục tiêu (PCR Biosystems, Vương quốc Anh) với các đoạn mồi đặc hiệu cho các gien như CD14, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 và
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GADPH) (Bảng 1). Các sản phẩm khuếch đại được quan sát bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% và nhuộm bằng ethidium bromide (Sigma, USA).
Bảng 2.1. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien đặc hiệu của TBGTM
Gien Đoạn mồi (5’-3’) Độ dài
sản phẩm PCR (bp) Tham khảo Gapdh Mồi xuơi AGACACGATGGTGAAGGTCG 164 NM_0010 82253.1 Mồi ngược CTTGCCGTGGGTGGAATCAT CD14 Mồi xuơi TGCCTAAGGGACTGCCTG 132 NM_0010 82195.2 Mồi ngược CAGGGACCAGGAACGGATT CD34 Mồi xuơi CATCCTGGGCACTACTGGC 115 XM_0082 68472.2 Mồi ngược GCATGTGCAGACTCCTTTCC
CD44 Mồi xuơi AGGTTTGGTGGAAGACCTGG 162 XM_0027 09048.3 Mồi ngược CTTCCTCCTCTGCCATGAGT CD45 Mồi xuơi CAATTACCTGGACACCTCCTC 221 XM_0082 68698.2 Mồi ngược CTGACAGCTTGAAGCACTTC CD73 Mồi xuơi GAGCTCACGATCCTGCACAC 142 XM_0173 45272.1 Mồi ngược CTTGGCGGATCTGTTGCACT CD90 Mồi xuơi CTCTGTGCTCAGAGACAAGC 135 XM_0027 22718.3 Mồi ngược CCAACCAGTCACAGGGAAAG CD105 Mồi xuơi CGCTCTGGTGCATCTACTCG 108 XM_0082 51029.2 Mồi ngược CGATGCTGTGGTTCGTGCT CD106 Mồi xuơi TCCCCGAATCCAGATCTCTTGC 134 NM_0010 82152.1 Mồi ngược CTCGCTCCTCACCTTCCCAT
Phân tích và diễn giải số liệu thu được:
TBGTM thu nhận được từ mơ mỡ thỏa mãn ít nhất 2 tiêu chí theo tiêu chuẩn của ISCT.
2.4.2. Quy trình tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM mỡ thỏ và màng chân bì 2.4.2.1. Khảo sát sự biểu hiện của các gien tạo sụn
TBGTM sau cấy chuyền lần thứ 3 sẽ được cảm ứng biệt hĩa tạo sụn bằng mơi trường StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco™). Sau khi cảm ứng biệt hĩa, các yếu tố tăng trưởng kích thích sự biệt hĩa của các tế bào thơng qua sự hoạt hĩa các gien đặc trưng cho sự hình thành sụn. Ở các giai đoạn hình thành và phát triển thành tế bào sụn, sự biểu hiện gien của tế bào khác nhau. Sự thay đổi của các gien đặc trưng theo thời gian cĩ thể chỉ ra giai đoạn của sự hình thành sụn.
Quy trình thực hiện:
TBGTM sau khi cảm ứng tạo sụn 7, 14, 21 ngày được đánh giá sự biểu hiện của các gien sox9, col2a1, col1a2, col X, acan, runx2.
TBGTM sau khi cảm ứng biệt hĩa 7, 14 và 21 ngày được mang đi tách chiết RNA bằng Easy- Spin ™ (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc).
Các gien tạo sụn được khuếch đại bằng các cặp mồi đặc trưng (Bảng 2.2).
RNA thu nhận từ sụn thỏ được sử dụng như đối chứng dương.
Quy trình qRT-PCR được mơ tả ở phần phụ lục 1.
Bảng 2.2. Danh sách các đoạn mồi khảo sát các gien tạo sụn
Gien Đoạn mồi (5’-3’) Độ dài
sản phẩm PCR (bp) Tham khảo Sox-9 Mồi xuơi AGCTCACCAGACCTTGAGAC 197 XM_0082 71763.2 Mồi ngược GTTGGGTACCAGTTGCCTTC Col I Mồi xuơi CAATGGTGGCACCCAGTTTG 258 NM_0011 95668.1
Mồi ngược GTGCAGCCATCGACAAGAAC Col II Mồi xuơi GGCTGGAGGATTTGACGAGA 135 NM_0011 95671.1 Mồi ngược CCAGGGTTGCCTTGAAATCC Col X Mồi xuơi GTCCTTCTGGACCACCAGGA 100 XM_0027 14724.3 Mồi ngược GGCTTCCCAGTGGCTGATAG Aggrecan Mồi xuơi TGGGTGTCAGGACCGTGTAC 155 XM_0082 51723.2 Mồi ngược CGTCTGGACCGTGATGTCCT Runx2 Mồi xuơi GATGACACTGCCACTTCTGAC 165 XM_0082 62992.2 Mồi ngược GTGGCTGGATAGTGCATTCG Đánh giá kết quả:
Sự thay đổi biểu hiện các gien tạo sụn của TBGTM sau khi cảm ứng biệt hĩa 7, 14, 21 ngày so với TBGTM khơng được cảm ứng theo cơng thức Livak:
- ΔCt (gien) = Ct (gien) – Ct (GapDH)
- ΔΔCt = ΔCt (gien nhĩm cảm ứng) - ΔCt (gien nhĩm khơng cảm ứng) Các số liệu được xử lí thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 6.0. P-value <0,05 được xem sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê.
sau:
2.4.2.2. Thu nhận giá thể màng chân bì từ da người
Mơ da được cắt ra thành các mảnh cĩ kích thước 1x2 cm2. Dùng dao loại bỏ các mơ thừa như mơ mỡ, mạch máu, chỉ giữ lại phần chân bì và thượng bì.
Mơ da lần lượt được xử lý với các dung dịch: NaCl 1M, EDTA, dung dịch nhược trương, dung dịch SDS, PBS theo quy trình sau:
Sau mỗi lần xử lý với các dung dịch trên, mẫu mơ đều được quay ly tâm lạnh 200 vịng/phút trong 5 phút, lặp lại 3 lần, nhằm làm sạch mẫu mơ.
Mẫu mơ sau khi được xử lý sẽ được bảo quản theo quy trình đơng lạnh, rồi đem đơng khơ:
Bảo quản mẫu mơ trong tủ lạnh 40C trong vịng 30 phút, -200C trong vịng 1 giờ, sau đĩ chuyển sang bảo quản ở nhiệt độ -800C trong vịng 24 giờ.
Đơng khơ mẫu chân bì ở áp suất 0.4 mbar trong vịng 48 giờ.
Mẫu mơ được đĩng gĩi và đem khử trùng bằng tia gamma với liều chiếu 25 kGy theo chuẩn ISO 11137-03 và theo các tài liệu trên thế giới [35], [64]. Với liều chiếu này sẽ đảm bảo mẫu mơ đạt độ vơ trùng SAL ≤ l0-6.
Bảo quản màng chân bì ở nhiệt độ phịng.
Đánh giá cấu trúc của màng chân bì
Màng chân bì được thu nhận sẽ được đánh giá cấu trúc mơ học theo 3 thời điểm khác nhau trong quá trình nghiên cứu: (1) mẫu mơ da trước khi xử lý, (2) mẫu mơ sau khi được loại bỏ lớp thượng bì và (3) mẫu màng chân bì hồn tất.
Dựa vào hình ảnh mơ học để đánh giá cấu trúc của màng chân bì trước và sau khi xử lý cũng như so sánh với một tác giả nghiên cứu khác để đánh giá cấu trúc của màng.
Sử dụng kỹ thuật chụp SEM để khảo sát 2 phía bề mặt của màng chân bì sau khi hồn tất quy trình xử lý để khảo sát cấu trúc bề mặt của màng.
Chỉ tiêu đánh giá: Cấu trúc màng chân bì sau xử lý chỉ cịn kết cấu khung sợi collagen, khơng cĩ sự hiện diện của tế bào.
Đánh giá khả năng gây độc tính của màng chân bì đối với tế bào
Sử dụng TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ để đánh giá khả năng gây độc cĩ thể cĩ của màng chân bì đối với tế bào (dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993-5):
+ Ngâm màng chân bì trong chai nuơi cĩ chứa các TBGTM đang tăng trưởng trong vịng 24 – 48 giờ.
+ Quan sát sự phát triển của TBGTM khi cĩ sự hiện diện của màng chân bì. + Quan sát và ghi nhận kết quả.
Sử dụng màng chân bì để nuơi các TBGTM trong thời gian 1 tuần để đánh giá khả năng gây độc của màng chân bì đối với TBGTM trong thời gian nuơi cấy dài ngày.
+ Màng chân bì được sử dụng làm giá thể để nuơi cấy TBGTM.
+ Dịch huyền phù TBGTM (mật độ TBGTM ở khoảng 106 – 107 tế bào/cm2) sẽ được chuyển lên màng chân bì bằng phương pháp quay ly tâm ở tốc độ 1000 vịng/phút trong 1 phút, lặp lại 5 lần.
+ Nuơi các màng chân bì cĩ chứa tế bào trong tủ ủ ấm.
+ Mỗi 2 ngày thay mơi trường nuơi mới một lần. Nuơi trong khoảng thời gian 1 tuần.
+ Sau 1 tuần nuơi cấy, thu nhận các màng chân bì đi nhuộm mơ học để quan sát sự phát triển và tăng trưởng của TBGTM bên trong các giá thể màng chân bì.
2.4.2.3. Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM và màng chân bì
Sau khi cĩ được TBGTM từ mơ mỡ (ở lần cấy chuyền thứ ba) và màng chân bì da người. Nhĩm nghiên cứu kết hợp hai yếu tố này để tạo tấm tế bào sụn theo nguyên tắc của cơng nghệ mơ (kết hợp của 3 yếu tố là tế bào, giá thể và các yếu tố sinh học).
Quy trình thực hiện:
- TBGTM được nuơi trên đĩa 6 giếng, khi mật độ tế bào phủ kín bề mặt đĩa nuơi sẽ thay mơi trường nuơi cơ bản bằng mơi trường biệt hĩa sụn (StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit). Mơi trường biệt hĩa được thay mỗi 3 ngày.
- Chuẩn bị 2 đĩa nuơi TBGTM trong mơi trường biệt hĩa. Sau 7 ngày cảm ứng biệt hĩa tạo sụn, màng chân bì sẽ được đưa vào đĩa 1 để tiến hành chuyển lớp TBGTM lên màng. Lớp TBGTM sẽ được bĩc tách ra khỏi đĩa nuơi bằng lực cơ học và cuộn quanh mảnh màng chân bì được chuẩn bị sẵn. Sau đĩ tấm tế bào tiếp tục nuơi trong mơi trường biệt hĩa sụn. Quan sát hình thái và cấu trúc lớp TBGTM bám dính lên màng chân bì dưới kính hiển vi đảo ngược.
- Đến ngày thứ 14, tiến hành chuyển màng chân bì bên đĩa 1 sang đĩa 2, tiến hành bĩc lớp TBGTM bên đĩa 2 và cuộn quanh màng chân bì lần thứ 2. Sau đĩ tấm tế bào sụn tiếp tục nuơi trong mơi trường biệt hĩa sụn đến ngày thứ 21.
- Tấm tế bào sụn sau đĩ được mang đi chụp SEM và nhuộm mơ học để đánh giá đặc điểm cấu trúc và tế bào học.
2.4.2.4. Đánh giá một số đặc điểm của tấm tế bào sụn được tạo bằng mơ học và SEM
Đánh giá tấm tế bào sụn:
Nhuộm mơ học (H&E và Trichrome) : để đánh giá cấu trúc tấm tế bào sụn, sự phân bố của tế bào bên trong tấm tế bào.
Chụp SEM: đánh giá cấu trúc bề mặt và sự hiện diện và bám dính của tế bào trên bề mặt giá thể.
Nhuộm Safranin-O: để đánh giá sự hiện diện của nguyên bào sụn bên trong tấm tế bào.
2.4.3. Xây dựng mơ hình đánh giá hiệu quả phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp in vivo của tấm tế bào sụn trên mơ hình thỏ
Đối với mục tiêu này, chúng tơi cũng tiến hành lập lại quy trình tạo tấm tế bào sụn đã chuẩn hĩa. Tiến hành thu nhận và nuơi cấy TBGTM từ mỡ thỏ, tiếp theo sẽ cảm ứng biệt hĩa TBGTM trong mơi trường tạo sụn và chuyển lên giá thể màng chân bì đã thu nhận trước đĩ. Tấm tế bào sụn thu nhận được sẽ được ghép vào vùng sụn ở khớp gối của thỏ đồng loại.
2.4.3.1. Tạo mảnh ghép tấm tế bào sụn từ TBGTM mỡ thỏ và màng chân bì
Quy trình thực hiện
Chọn các thỏ đực khoảng 6 tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuơi trong điều kiện dinh dưỡng và chăm sĩc như nhau.
30 phút trước khi tiến hành phẫu thuật lấy mơ mỡ, thỏ sẽ được tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lơng vùng da bụng thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật bằng betadine.
Gây mê thỏ bằng Zoletil® 50 với liều 10 mg/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu.
Dùng dao phẫu thuật rạch da bụng, bĩc tách lấy mơ mỡ ở vùng dưới da. Mơ mỡ sau khi lấy ra được đựng trong tuýp 50 ml, và chuyển về phịng thí nghiệm để thực hiện theo các quy trình thu nhận TBGTM.