Hình 2 .4 Sơ đồ phản ứng gắn APTES lên hạt nanoFe3O4/SiO2
Hình 2.7 Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR
Với thế tăng tốc V = 100 kV, ta cĩ bước sĩng điện tử là 0,00386 nm. Nhưng với thế tăng tốc cỡ 200 kV trở nên, vận tốc của điện tử trở nên đáng kể so với vận tốc ánh sáng, và khối lượng của điện tử thay đổi đáng kể, do đĩ phải tính theo cơng thức tổng quát (cĩ hiệu ứng tương đối tính):
2 c . m 2 eV 1 1 . V . e . m 2 h p h λ 0 0 (2.5)
Sau đĩ chùm điện tử được hội tụ, thu hẹp nhờ hệ thấu kính từ và được chiếu xuyên qua mẫu quan sát đã được làm mỏng đến độ dày cần thiết để điện tử xuyên qua. Ảnh sẽ được tạo bằng hệ vật kính phía sau vật, hiện ra trên màn huỳnh quang, hay trên phim ảnh, trên các máy ghi kỹ thuật số... Tất cả các hệ này được đặt trong buồng được hút chân khơng cao.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (conventional transmission electron microscopy) sử dụng chùm điện tử song song chiếu qua mẫu. Một loại kính hiển vi điện tử truyền qua khác là kính hiển vi điện tử truyền qua quét (scaning transmission electron microscopy - STEM) sử dụng một chùm điện tử hội tụ chiếu xuyên qua và quét trên mẫu, tạo độ phân giải cao hơn nhiều.
Dựa vào ảnh TEM, chúng ta cĩ thể biết được hình dạng và kích thước hạt ở kích cỡ vài nanơ mét vì TEM cĩ độ phân giải cỡ A0
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscope) là một cơng cụ thiết yếu để phân tích một cách trực quan các vật liệu nano. TEM cĩ khả năng quan sát các cấu trúc và hình
dạng của mẫu.
Mẫu phân tích là mẫu lỏng, được phủ lên trên lưới đồng, nano kim loại sẽ bám vào bề mặt lưới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, Hiệu JEOL-Nhật, Model JEM-1400, điện thế gia tốc là: 100 kV tại phịng thí nghiệm trọng điểm Quốc Gia Vật liệu Polymer và Composite, ĐH Bách
Khoa, Tp.HCM. Sau khi tinh chỉnh máy để đạt được ảnh TEM của hạt nano kim loại rõ nét nhất, các ảnh TEM sẽ được chụp và gửi dữ liệu đến máy tính dưới dạng file ảnh. 2.2.4 Từ kế mẫu rung (VSM)
Từ kế mẫu rung hoạt động theo nguyên tắc cảm ứng điện từ, đo mơmen từ của mẫu cần đo dưới tác dụng của từ trường ngồi. Vật liệu hạt được đặt vào trong một từ trường đồng nhất và tạo dao động rung theo hình sin với vật liệu. Khi đĩ sẽ cĩ một sự thay đổi từ thơng trong mẫu vật, gây ra dịng cảm ứng trong cuộn dây, ứng với một điện thế tỉ lệ với mơmen từ của vật liệu.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là một vật sắt từ, cĩ mơmen I, dao động ở gần một cuộn dây, sẽ gây ra trong cuộn dây đĩ một suất điện động cảm ứng tỷ lệ với I. Gắn mẫu sắt từ vào đầu một thanh rung
và đặt giữa hai cực của một nam châm điện. Sát hai bên cuộn dây mẫu cĩ hai cuộn dây nhỏ giống nhau, cĩ chiều cuốn ngược nhau và được mắc nối tiếp. Khi mẫu dao động, suất điện động xuất hiện ở hai đầu các cuộn dây nhỏ tỷ lệ với độ từ hĩa của mẫu. Các giá trị về độ từ hố và từ trường tương ứng của việc đo từ kế mẫu rung cĩ thể vẽ lên được đường cong từ hố đặc trưng cho mỗi vật liệu. Như đã nĩi, từ kế mẫu rung đo mơmen từ của vật liệu từ. Đơn vị của mơmen từ
thường sử dụng trong từ kế mẫu rung là emu/g, và tùy theo việc đo mơmen từ theo đại lượng nào sẽ cĩ phép đo tương ứng đĩ:
Phép đo từ hĩa, từ trễ: Đo sự biến đổi của mơmen từ theo từ trường ngồi.
Phép đo mơmen từ theo sự thay đổi của nhiệt độ dưới tác dụng của một từ trường ngồi: phép đo từ nhiệt. Dựa vào phép đo từ nhiệt, cĩ thể thực hiện các phép đo động học từ tính, hay động học kết tinh của vật liệu từ.
Đo thay đổi mơmen từ theo thời gian: đo phục hồi
Xác định các tính chất dị hướng dựa vào việc quay vật liệu (bộ phận quay của VSM).
2.2.5 Phổ tử ngoại khả kiến
Phổ UV –Vis là loại phổ electron. Ứng với mỗi electron chuyển mức năng lượng ta thu được một vân phổ rộng phương pháp đo phổ UV –Vis là một phương pháp định lượng, xác định nồng độ của các chất thơng qua độ hấp thu của dung dịch. Cho chùm ánh sáng cĩ độ dài bước sĩng xác định cĩ thể thấy được (Vis) hoặc khơng thấy được (UV-IR) đi qua vật thể hấp
thu (thường ở dạng dung dịch). Dựa vào lượng ánh sáng đã bị hấp thu bởi dung dịch mà suy ra nồng độ của dung dịch đĩ.
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM
3.1 Hĩa chất và dụng cụ
Bảng 3.1. Danh mục các hĩa chất
STT Hĩa chất Cơng thức phân tử Hãng sản xuất
1 Sắt (II) clorua FeCl2.4H2O Sigma
2 Sắt (III) clorua FeCl3.6H2O Sigma
3 Ethanol C2H5OH Đức
4 Tetraethyl orthosilicate (TEOS)
Si(OC2H5)4 Đức
5 Amoniac NH4OH Sigma
6 3-amino propyl
triethoxysilane -(APTES)
C9H23NO3Si Sigma
7 Glutaraldehyde C5H8O2 Sigma
8 Albumin from bovine serum Sigma
9 Ethylene glycol C2H6O2 Merck
10 Poly ethylene glycol 2000 C4H6O2 Sigma
11 Sodium acetate trihydrate CH3COONa.3H2O Merck
Ngồi ra cịn một số hĩa chất như: Coomasie Brilliant Blue G-250, dung dịch đệm PBS với pH 7.4 (Phosphate Buffered Saline) được sử dụng trong việc xác định protein theo phương pháp Bradford.
Dụng cụ: Máy khuấy từ, máy khuấy cơ, máy siêu âm, lị nung, lọ thuỷ tinh, cân điện tử, pipet, lọ sứ, cối – chày sứ, kẹp gắp, muỗng nhỏ…
3.2 Quy trình tổng hợp hạt nano Fe3O4
3.2.1 Tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa.
3.2.2 Tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp solvothermal.
3.3 Quy trình bọc SiO2 lên hạt nano Fe3O4
1,35g FeCl3.6H2O + 40ml ethylen glycol
Thêm 4,8g NaAc và 0,5g PEG-2000
Chuyển hỗn hợp vào autoclave, duy trì ở nhiệt độ 2000C
Lắng bằng nam châm, rửa với ethanol Sấy khơ ở700C trong chân khơng
Khuấy cơ ở nhiệt độ 800C trong mơi trường khí N2
Khuấy cơ ở nhiệt độ 800C trong mơi trường khí N2
Hình 3.2. Quy trình tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp solvothermal[28].
Để nguội ở nhiệt độ phịng
3,1736g FeCl2.4H2O +7,5684g FeCl3.6H2O + 320ml nước cất hai lần
Nhỏ chậm 40ml Amoniac (NH4OH)
Khuấy cơ ở nhiệt độ 800C trong mơi trường khí N2
Để nguội đến nhiệt độ phịng, lắng hạt bằng nam châm, rửa bằng nước ấm
Khuấy cơ ở nhiệt độ 800C trong mơi trường khí N2
Sấy khơ ở nhiệt độ 700C trong mơi trường chân khơng
Thay đổi các tỉ lệ hạt nano Fe3O4 trên thể tích nước, tỉ lệ thể tích giữa ethanol với amoniac, nước và TEOS[4]. Thay đổi thời gian khuấy cơ /siêu âm để khảo sát các yếu tố tới hạt nano Fe3O4/SiO2.
3.4 Quy trình phủ APTES lên hạt nano Fe3O4/SiO2
50mg hạt nano Fe3O4 + 20ml nước cất
Thêm 80ml ethanol và 5ml amoniac
Nhỏ chậm 2ml TEOS
Lắng bằng nam châm, rửa với ethanol và nước cất Siêu âm 15 phút
Siêu âm 15 phút
Hình 3.3. Quy trình bọc SiO2 lên hạt nano Fe3O4
Khuấy cơ/siêu âm 4 giờ
Sấy khơ ở 700C trong chân khơng
100mg hạt nano Fe3O4/SiO2 + 3,55ml ethanol + 3,55ml nước cất
Nhỏ chậm 0,4ml APTES
Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nước cất
Sấy khơ ở nhiệt độ700C
Siêu âm 30 phút
Siêu âm 2 giờ
Hình 3.4. Quy trình phủ APTES lên hạt nano Fe3O4/SiO2
3.5 Quy trình gắn Albumin lên hạt nano Fe3O4/SiO2
* Ước lượng Albumin bám dính hạt từ bằng phương pháp Bradford[24].
- 3ml dung dịch Bradford được cho vào 100µl dung dịch mẫu gồm: Sáu mẫu dung dịch albumin đã biết trước nồng độ và các mẫu dung dịch albumin thuộc phần nổi. - Đo độ hấp thu ở bước sĩng 595nm
- Từ độ hấp thu của các mẫu lập phương trình đường chuẩn.
- Từ phương trình đường chuẩn và độ hấp thu của các mẫu thuộc phần nổi suy ra nồng độ albumin thuộc phần nổi.
- Từ đĩ suy ra được lượng albumin bám dính hạt từ.
100mg hạt nanoFe3O4/SiO2/APTES+4ml dung dịch Glutaradehyde 25%
Thêm vào lượng albumin trong dung dịch đệm PBS
Tách từ và rửa trong dung dịch đệm 3 lần
Phần nổi (là dung dịch Albumin khơng bám dính
Hạt từ )
Khuấy qua đêm ở nhiệt độ phịng
Ủ bằng cách khuấy 5 giờ ở nhiệt độ phịng
Hình 3.5. Quy trình gắn albumin lên hạt nano Fe3O4/SiO2
Phần lắng là hạt nano Fe3O4
3.6 Quy trình gắn kháng thể khuẩn tả Vibrio cholerae-O1 lên hạt nano Fe3O4/SiO2
Ước lượng kháng thể Vibrio Cholerae-01 bám dính hạt từ theo phương pháp
Bradford.
- 3ml dung dịch Bradford được cho vào 100µl dung dịch mẫu gồm: Tám mẫu
dung dịch kháng thể Vibrio Cholerae-01 đã biết trước nồng độ và các mẫu dung dịch kháng thể Vibrio Cholerae -01 thuộc phần nổi.
- Đo độ hấp thu ở bước sĩng 595nm
- Từ độ hấp thu của các mẫu lập phương trình đường chuẩn.
- Từ phương trình đường chuẩn và độ hấp thu của các mẫu thuộc phần nổi suy ra
nồng độ kháng thể Vibrio Cholerae -01 thuộc phần nổi.
- Từ đĩ suy ra được lượng kháng thể Vibrio Cholerae -01 bám dính hạt từ.
3.7 Quy trình chẩn đốn tiêu chảy cấp.
8 mẫu kháng nguyên Vibrio Cholerae-01 đã biết trước nồng độ cho vào 8 mẫu hạt từ đã gắn kháng thể Vibrio Cholerae -01. Kháng thể Vibrio Cholerae -01 kết hợp với kháng nguyên Vibrio Cholerae -01. Sau đĩ thêm cơ chất. Enzym biến đổi cơ chất và
phát quang. Dùng nam châm, tách phần hạt từ cĩ gắn kháng nguyên và kháng thể
Vibrio Cholerae-01 với phần dung dịch nổi phát quang. Đo độ hấp thu ở bước sĩng
450 nm của phần nổi. Từ đĩ thiết lập đường chuẩn mối liên hệ giữa độ hấp thu bước
sĩng 450 nm và nồng độ kháng nguyên Vibrio Cholerae -01 trong mẫu.
Cho các mẫu huyết thanh vào các mẫu hạt từ đã gắn kháng thể Vibrio Cholerae -
01, sau đĩ cho cơ chất. Dùng nam châm tách phần nổi với phần hạt từ. Đo độ hấp thu bước sĩng 450 nm của phần nổi và dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ kháng nguyên cĩ trong các mẫu huyết thanh.
30mg hạt nanoFe3O4 + dung dịch kháng thể O1 cĩ nồng độ
Tách từ và rửa trong dung dịch đệm 3 lần
Phần nổi dùng để định lượng kháng thể O1 khơng dính
Ủ ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ
Hình 3.6. Quy trình gắn kháng thể O1 lên hạt nano Fe3O4/SiO2
Phần lắng là hạt nano Fe3O4 Được gắn kháng thể O1
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 Điều khiển kích thước hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa
Kích thước hạt là một trong những yếu tố quan trọng, tùy vào kích thước mà ta cĩ thể ứng dụng chẩn đốn những bệnh khác nhau. Qua đĩ, nhằm tìm ra điều kiện để tạo hạt cĩ kích thước mong muốn để phục vụ cho việc chẩn đốn và trị bệnh trong y sinh học.
4.1.1 Khảo sát theo nhiệt độ
Chúng tơi khảo sát nhiệt độ như sau: nhiệt độ 300C, nhiệt độ 500C, nhiệt độ 800C trong mơi trường sục khí N2 và tỷ lệ mol Fe2+:Fe3+ là 1:2.
Bảng 4.1. Khảo sát hạt nano ơxít sắt ở ba nhiệt độ khác nhau.
Mẫu Nhiệt độ tạo hạt (0C) FeCl2.4H2O (g) FeCl3.6H2O (g) Lượng NH4OH (25%,mL) Tốc độ khuấy (rpm) Kích thước (nm) M1 30 2,786 7,5684 40 850 12,05-17 M2 50 2,786 7,5684 40 850 10,25-15 M3 80 2,786 7,5684 40 850 8,7-13,5
Qua ảnh TEM của ba mẫu cho thấy : M1 nhiệt độ 300C kích thước 12,5 -17 nm, M2 nhiệt độ 500C kích thước 10,25 -15 nm, M3 nhiệt độ 800C kích thước 8,7 -13,5 nm. Như vậy ta nhận thấy rằng khi lượng NH4OH cho vào khơng thay đổi là 40 mL, tỉ lệ mol Fe2+: Fe3+ là 1:2, nhưng thay đổi nhiệt độ tăng dần, kích thước hạt giảm. Bởi vì, khi nhiệt độ cao thì sự hình thành mầm tăng trên cùng một lượng Fe2+, Fe3+ và NH4OH số hạt tạo ra nhiều nên kích thước hạt nhỏ.
(a) (b) (c)
(a) (b) (c)
Hình 4.2. Ảnh TEM của hạt Fe3O4 ở nhiệt độ 500C: a) 20 nm; b) 50 nm; c) 100 nm
(a) (b) (c)
Hình 4.3. Ảnh TEM của hạt Fe3O4 ở nhiệt độ 800C: a) 20 nm; b) 50 nm; c) 100 nm
Kết luận: Khi nhiệt độ phản ứng thay đổi, kích thước hạt Fe3O4 tạo thành cũng bị ảnh hưởng theo. Ảnh TEM cho thấy kích thước hạt tăng khi nhiệt độ phản ứng giảm. Ở mẫu M3 nhiệt độ 800C, kích thước hạt tương đối nhỏ và khá đồng đều, hình dạng khá cầu, do nhiệt độ cao thì sự hình thành mầm tăng trên cùng một lượng Fe2+, Fe3+ và lượng NH4OH nên số hạt tạo ra nhiều do đĩ kích thước hạt nhỏ, và dao động trong khoảng 8,7nm – 17nm.
4.1.2 Khảo sát thay đổi lượng NH4OH
Ba mẫu M4, M5, M6 được tổng hợp như trong bảng 4.2 , tỷ phần mol Fe2+ : Fe3+là 1 : 2, nhiệt độ 800C, cĩ sục khí N2 nhưng thay đổi lượng NH4OH theo chiều hướng tăng dần như sau:
Bảng 4.2. Khảo sát hạt nano ơxít sắt khi lượng NH4OH thay đổi.
Mẫu FeCl2.4H2O (g) FeCl3.6H2O (g) Nhiệt độ (0C) Lượng NH4OH (mL) Tốc độ Khuấy (rpm) Kích thước hạt (nm) M4 2,786 7,5684 80 20 850 11,25 - 15 M5 2,786 7,5684 80 40 850 8,7 - 13,5 M6 2,786 7,5684 80 70 850 8,5 - 12,5
Sau khi tạo được hạt nano Fe3O4 với lượng NH4OH được thay đổi như sau: 20 mL, 40 mL và 70 mL, với tỷ lệ mol Fe2+ : Fe3+1: 2, tốc độ khuấy và nhiệt độ khơng thay đổi. Kết quả ảnh TEM của ba mẫu:
(a) (b) (c)
Hình 4.4 Ảnh TEM lượng NH4OH là 20 mL, a) 20 nm, b) 50 nm, c) 100 nm
(a) (b) (c)
Hình 4.5 Ảnh TEM lượng NH4OH là 40mL, a) 20 nm, b) 50 nm, c) 100 nm
Hình 4.6 Ảnh TEM lượng NH4OH là 70mL, a) 20 nm, b) 50 nm, c) 100 nm
Kết luận: Qua kết quả ảnh TEM ba mẫu M4, M5, M6 thu được từ thực nghiệm, chúng tơi rút ra kết luận: kích thước hạt nano Fe3O4 phụ thuộc vào lượng NH4OH cho vào, khilượngNH4OH càng tăng thì kích thước hạt càng giảm nhưng khơng nhiều. Bởi vì, khi tăng lượng NH4OH chính là tăng mơi trường bazơ, tăng độ pH, nên tốc độ phản ứng nhanh, sự phát triển mầm càng nhiều dẫn đến tăng số hạt Fe3O4 làm cho hạt cĩ kích thước nhỏ. Hình dạng hạt tương đối khá cầu, phân tán đồng đều, đa số hạt cĩ kích thước vào khoảng 8,5 – 15 nm.
4.1.3 Khảo sát nồng độ Fe2+và Fe3+ban đầu
Pha ba mẫu M7, M8, M9 với số liệu trong bảng 4.3 ta giữ nguyên khối lượng sắt theo tỷ lệ 1:2 nhiệt độ 800C ổn định, lượng NH4OH khơng thay đổi trongquá trình tạo hạt, nhưng thay đổi nồng độ Fe2+, Fe3+ ban đầu theo chiều hướng tăng dần. Tuy nhiên trong q trình tạo hạt ta luơn luơn sục khí N2.
Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ Fe2+, Fe3+ ban đầu
Mẫu FeCl2.4H2O (g) FeCl3.6H2O (g) Nhiệt độ (0C) Nồng độ Fe2+và Fe3+ (mol/L) Lượng NH4OH (mL) Kích thước hạt (nm) M7 2,786 7,5684 80 440ml 40 15,5– 21 M8 2,786 7,5684 80 320ml 40 8,7-13,5 M9 2,786 7,5684 80 260ml 40 8,4 – 12,7 (a) (b) (c) Hình 4.7. Ảnh TEM Nồng độ Fe2+, Fe3+ 440mL, a) 20 nm b) 50 nm, c) 100 nm
Qua ảnh TEM mẫu M7 hình 4.7 chúng tơi nhận thấy hạt khơng được tơi và bị kết dính lại với nhau, hình dạng khơng được cầu và xác định kích thước bằng cơng thức Scherrer, đường kính trung bình hạt vào khoảng 15,5nm – 21nm.
- Đối với mẫu M8 hình 4.8 tương đối rõ ràng khơng bị kết tụ vào nhau, hình dạng hạt khá cầu, tương đối đồng đều. Qua việc xác định kích thước hạt vào khoảng 8,7- 13,5nm.
(a) (b) (c)
Hình 4.8 Ảnh TEM Nồng độ Fe2+, Fe3+ 260mL, a) 20 nm, b) 50 nm, c) 100 nm
- Mẫu M9 quan sát ảnh TEM hình 4.9 ta thấy hạt tương đối đồng đều, hình dạng cầu, kích thước hạt vào khoảng 8,4nm – 12,7nm.
(a) (b) (c)
Hình 4.9. Ảnh TEM Nồng độ Fe2+, Fe3+ 200mL, a) 20 nm, b) 50 nm, c) 100 nm
Kết luận: Qua kết quả trên ta thấy kích thước hạt giảm dần từ M7 đến M9, là do thay đổi lượng H2O là thay đổi nồng độ Fe2+, Fe3+ ban đầu dẫn đến thay đổi nồng độ các chất (muối, ...) ban đầu làm cho ảnh hưởng đến tốc độ hình thành Fe3O4 (kích thước