CHƢƠNG II : CHẾ TẠO VÀ HOẠT HÓA BỀ MẶT SỢI NANO
2.2 Phƣơng pháp chức năng hóa bề mặt
2.2.2 Qui trình chức năng hóa bề mặt sợi Si
Hình 2.21: Sơ đồ khối các bước chức năng hóa bề mặt chip sợi Silic
Vật liệu làm cảm biến là ngun tố Silic do đó nó khơng thể nhận biết các phân tử sinh học mong muốn nên ta phải sử dụng một chất kết nối (linker) có tính chất một đầu bám chặt vào bề mặt sợi Si, đầu kia có khả năng hình thành liên kết với các thụ thể hoặc các phân tử khác cần thiết cho việc gắn thụ thể. Chất kết nối này có hai nhóm chứa năng: một nhóm chức năng gắn lên bề mặt vật liệu, nhóm cịn lại gắn với phân tử làm cảm biến.
Chip sợi Si sau khi chế tạo bề mặt sợi Si sẽ phản ứng với oxi trong mơi trƣờng hình thành một lớp mỏng SiO2 tự nhiên với độ dày khoảng 2-5nm. Từ lớp oxit tự nhiên bao bọc bên ngồi sợi Si này sử dụng phƣơng pháp silane hóa (silanization) để biến đổi bề mặt chip sợi Si.
Silane hóa (Silanization) là phản ứng hình thành liên kết cộng hóa trị giữa một hợp chất silane bề mặt, đó có thể là chlorosilane hay alkyloxysilane, hay với phân tử silane khác thông qua nối siloxane. Bề mặt hydroxyl hóa của SiNW (Si - OH) phản ứng với dung dịch chứa dẫn xuất silane ở pha lỏng, trong một dung mơi hữu cơ hay có thể ở pha khí, khi có sự hiện diện của khí argon (Ar). Bề mặt SiNW phải đƣợc làm sạch bằng ethanol, acetone hay bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2O2 và H2SO4),
giúp đồng thời loại bỏ nhiễm cacbon và tạo các nhóm chức silanol (Si – OH) trên bề mặt nhờ sự bẻ gãy các liên kết siloxane.
Hình 2.22: Cơ chế hình thành lớp SAM trên bề mặt Si-OH
Cơ chế hình thành lớp SAM qua q trình silane hóa bao gồm 4 bƣớc:
- Đầu tiên là sự hấp thụ vật lý trên bề mặt, các phân tử silane sau khi hút bám lên bề mặt silic sẽ đƣợc hydrate hóa.
- Tiếp theo, các nhóm đầu (head - group) sẽ tham gia phản ứng thủy phân với bề mặt
- khi có sự hiện diện của lớp nƣớc trên bề mặt, hình thành các trihydroxysilane – - Si(OH)3 phân cực mạnh.
- Các nhóm – Si(OH)3 sẽ hình thành các liên kết cộng hóa trị với nhóm – OH trên bề mặt silic oxit (bƣớc 3), tiếp sau đó là phản ứng ngƣng tụ giữa các nhóm silanol của các phân tử liền kề nhau.
- Sau các bƣớc 1, 2 và 3, chỉ vài phân tử đƣợc hấp phụ trên bề mặt và lớp đơn đƣợc hình thành lúc này đang ở trạng thái sắp xếp không trật tự. Tuy nhiên, khi đƣợc giữ ở nhiệt độ cao trong một thời gian lâu hơn, lớp đơn thu đƣợc hoàn toàn kết đặc và sắp xếp có tổ chức (bƣớc 4).
Sau bƣớc silane hóa, bề mặt SiNW hoạt hóa có các nhóm chức amine, thiol, carboxy, hay epoxy v.v tùy thuộc vào hợp chất silane sử dụng. Một số chất kết nối silane thƣờng đƣợc sử dụng: 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), (3- aminopropyl)-dimethylethoxysilane (APDMES), N-(2-aminoethyl)-3- aminopropyltrimethoxysilane (AEAPS), 3-glycidoxypropyl trimethoxysilane (GPTS) v.v…
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng 3-glycidoxypropyl trimethoxysilane (GPTS) làm chất kết nối.
Hình 2.23: Linker 3-glycidoxypropyl trimethoxysilane (GPTS)
Qui trình thực nghiệm mà tơi sử dụng trong đề tài này gồm 4 bƣớc chính: 1. Rửa chip
2. Ngâm chip trong dung dịch GPTS với dung môi Toluene 3. Chiếu UV
4. Ngâm chip trong dung dịch kháng thể đơn dịng AFP (thụ thể)
Qui trình đƣợc giải thích cụ thể nhƣ sau:
Bƣớc 1: Rửa chip
Chip sợi Si sau khi đƣợc tạo thành hay lƣu trữ sẽ bị bụi bẩn, các tạp chất hữu cơ bám vào. Do đó, trƣớc tiên ta phải rửa sạch bề mặt của chip tạo điều kiện thuận lợi cho các bƣớc sau. Aceton và ethanol đƣợc sử dụng để làm sạch bề mặt chip.
Sau khi rửa chip với aceton-ethanol, ngâm chíp trong dung dịch Piranha. Dung dịch Piranha sẽ làm sạch các chất hữu cơ nhƣ DNA, protein trên bề mặt SiO2. Bên cạnh đó dung dịch piranha (hỗn hợp của H2O2 và H2SO4) sẽ tạo các nhóm chức silanol (Si – OH) trên bề mặt nhờ sự bẻ gãy các liên kết siloxane. Ở bƣớc này, chỉ nhỏ một giọt nhỏ Piranha lên chính giữa vùng hoạt động của chip để tránh tiếp xúc với các điện cực trên chip.
Bƣớc 2: Ngâm chip trong dung dịch GPTS với dung mơi Toluene
Để có đƣợc sự liên kết giữa bề mặt oxit của chip với những phần tử sinh học, lớp SiO2 cần đƣợc chức năng hóa với một phân tử có chức năng bắt giữ các phần tử sinh học, phân tử này sẽ có liên kết cộng hóa trị với với lớp SiO2 và đầu cịn lại có thể nối với phân tử sinh học. Phân tử có chức năng bắt các phân tử sinh học (chất kết nối) mà đƣợc sử dụng này là 3-glycidoxypropyl trimethoxysilane (GPTS).
GPTS đƣợc lựa chọn làm chất trung gian để tạo liên kết. Một đầu –OCH3 của GPTS sẽ nối với nhóm chức -OH trên bề mặt SiO2. Đầu cịn lại là nhóm chức epoxy sau khi đƣợc mở vịng sẽ liên kết với nhóm chức –NH2 của protein.
Bƣớc 3: Chiếu UV
Sau khi gắn GPTS lên bề mặt chip, đem chip đi chiếu UV. Dƣới tác dụng của UV, nhóm chức epoxy sẽ mở vịng.
Bƣớc 4: Ngâm chip trong dung dịch kháng thể đơn dịng AFP (thụ thể)
Để chip sợi Si có thể nhận diện một trong những chất chỉ thị sinh học trong ung thƣ gan là AFP cần phải gắn lên sợi Si một loại thụ thể tƣơng ứng mà có khả năng bắt cặp (tính đặc hiệu) với AFP. Thụ thể này là kháng thể đơn dòng AFP.
Lai với dung dịch AFP. Sau đó tiến hành đo điện.
Rửa chip bằng aceton và ethanol trong 5 phút. Sau đó lấy chip ra rửa lại với nƣớc DI. Xịt khơ chip bằng khí N2. Thực hiện q trình này 2 lần.
Chuẩn bị dung dịch Piranha- dung dịch bao gồm H2SO4 98% và H2O2 30% theo tỉ lệ 3:1. Sau đó ngâm chíp trong Piranha trong 3 phút. Rửa lại với nƣớc DI và xịt khơ bằng khí N2.
Chuẩn bị dung dịch 2% (v/v) 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS) với dung môi toluene. Ngâm chip vào dung dịch 2% GPTS trong 16 giờ. Rửa lại bằng cách ngâm chip trong dung môi toluene 3 lần, mỗi lần 5 phút. Lấy chip ra nung nhiệt tại nhiệt độ 1200C trong 15 phút.
Sau khi nung nhiệt xong, đem chiếu UV trong 15 phút.
Tiếp tục ngâm trong 10 μM kháng thể đơn dòng AFP trong 5 giờ tại nhiệt độ 40C.
Loại bỏ những thành phần thụ thể không gắn kết bằng cách ngâm dung dịch 0.1X PBS (pH 7.4) 3 lần, mỗi lần 5 phút.
Lai chip với AFP trong dung dịch 0.1X PBS (pH 7.4). Tiến hành đo.