CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. Đa hình đơn nucleotide
1.5.1. Đa hình đơn nucleotide và các phương pháp nghiên cứu
Đa hình đơn nucleotide (SNP) là một chỉ thị chỉ sự sai khác một nucleotide của trình tự DNA nhất định, có tần xuất xuất hiện cao ở hầu hết các hệ gen đã được nghiên cứu, điển hình như ở người cứ khoảng 1.250 nucleotide sẽ tìm thấy một nucleotide sai khác [60]. Sự sai khác của đơn hình nucleotide có thể xảy ra ở trong trình tự gen mã hóa (exon) hay trình tự gen không mã hóa (intron).
Một trong những nghiên cứu đa hình đơn nucleotide thường được sử dụng là kĩ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt bằng enzyme giới hạn. Tuy nhiên, kĩ thuật này chỉ xác nhận có sự đa hình đơn nucleotide trong trình tự phân tích chứ không xác định được chính xác sự thay đổi này là nucleotide loại nào. Vì thế, để xác định chính xác sự thay đổi của từng nucleotide trong gen nghiên cứu thì việc sử dụng các phương pháp hiện đại như Realtime PCR, giải trình tự, DNA chip là hết sức cần thiết [12], [13].
Ngoài các phương pháp trên, gần đây phương pháp phân tích đa hình bằng 4 mồi khác nhau hay còn gọi là Tetra tetra-primer ARMS-PCR [755]. Thường được sử dụng trong phân tích đa hình do những ưu điểm trong kĩ thuật và giá thành thực hiện. Nguyên lý của phương pháp này được trình bày tại hình 1.3. Sự thay thế alen G→A. Được sử dụng làm ví dụ minh họa trong hình dưới, ở đây cặp mồi xuôi ngoài (hồng) và ngược trong (đỏ) sẽ tạo ra sản phẩm đại diện cho alen G và cặp còn lại gồm xuôi trong (xanh lá) và ngược ngoài (xanh dương) sẽ đại diện cho alen A. Sự đặc hiệu của alen sinh ra do sự không bắt cặp cở đầu 3’ của một mồi với khuôn mẫu. Để nâng cao tính đặc hiệu một nucleotide không bắt cặp đặc hiệu được thiết kế ngay sát với alen cần phân tích (với dấu sao). Do khoảng cách giữa hai mồi ngoài tới vị trí alen đa hình có sự khác biệt nên có thể phân biệt bằng điện di nhằm xác định đa hình là đồng hợp G/G, A/A hay G/A.
Hình 1.3. Nguyên lý phương pháp phân tích đa hình bằng Tetra-primer
ARMS-PCR
1.5.2. Ứng dụng và tầm quan trọng của đa hình đơn nucleotide
Việc nghiên cứu đa hình đơn nucleotide có rất nhiều ứng dụng quan trọng. Bên cạnh việc lập bản đồ di truyền cho từng cá thể thì còn có ý nghĩa quan trọng trong việc phân tích đa dạng di truyền của một số bệnh nhất định hay tìm kiếm những chỉ thị điển hình cho một bệnh nhất định hay một số gen quan tâm [48], [55] .
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu đa hình đơn nucleotide còn có ý nghĩa quan trọng trong di truyền, chọn giống vật nuôi, cây trồng có năng suất, chất lượng tốt [70] .
1.5.3 Phương pháp PCR trong nghiên cứu đa hình đơn nucneotit (polymerase chain reactiotit).
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) chính là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Được tác giả Kary Mullis đưa ra năm 1985 và tác giả Saiki hoàn thiện năm 1988. Kỹ thuật PCR được thực hiện hoàn toàn trong các ống eppendoff thực hiện trong thời gian ngắn nhưng có thu được rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các
tác nhân vi sinh vật gây bệnh, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo ra giống mới với các đột biến định hướng...
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt [13].
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95
0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: (bắt cặp, annealing) ở bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Nhiệt độ này thường dao động trong khoảng 55 – 65 0C. Tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n. Trong đó
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa. n : Là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [13].