CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu
Tất cả bệnh nhân tiểu đường nghiên cứu được hỏi và thăm khám lâm sàng theo mẫu phiếu Thông tin bệnh nhân (Phụ lục 1), bao gồm:
- Chỉ tiêu lâm sàng: Thời gian phát hiện bệnh, Huyết áp, Triệu chứng lâm sàng chính (Triệu chứng kèm theo, Biến chứng đã xuất hiện).
- Chỉ tiêu cận lâm sàng: Xét nghiệm máu (Định lượng glucose máu lúc đói; Định lượng ure máu, creatinin máu; HbA1c), Xét nghiệm nước tiểu (Nước tiểu 10 thông số).
Tất cả các bệnh nhân đều được đánh giá mức độ chấp hành chế độ điều trị của bệnh nhân:
+ Chấp hành tốt các biện pháp điều trị theo hướng dẫn. + Không tự ý bỏ thuốc hoặc thay đổi phác đồ điều trị.
+ Có sổ theo dõi một số chỉ số như huyết áp, cân nặng, thời gian phát hiện tiểu đường glucose máu mao mạch tại nhà.
+ Bệnh nhân được khám, làm xét nghiệm máu và theo dõi sức khỏe định kỳ hàng tháng.
+ Kịp thời phát hiện các triệu chứng bất thường và phản ánh cho bác sỹ theo dõi.
2.4.2. Phương pháp xét nghiệm máu
Lấy 2ml máu của bệnh nhân vào ống nghiệm có chống đông Heparin để làm xét nghiệm Glucose, Ure, Creatinin. Thực hiện li tâm tách huyết thanh và phân tích các chỉ số trên máy sinh hóa tự động TC matric. Tiêu chí chẩn đoán tiểu đường (Theo các tiêu chí của Hiệp hội tiểu đường Mỹ năm 2018, dựa vào 1 trong 4 tiêu chuẩn: HbA1c ≥ 6,5% hoặc Glucose huyết lúc đói (ít nhất 8 giờ sau ăn) ≥ 7,0 mmol/l hoặc glucose huyết ngẫu nhiên ≥ 11,1 mmol/l hoặc glucose huyết 2 giờ sau khi thực hiện nghiệm pháp dung nạp glucose ≥ 11,1 mmol/l [11]. Suy thận: khi mức lọc cầu thận< 60 ml/phút ước tính theo Cockcroft và Gault. Các giai đoạn suy thận dựa vào mức lọc cầu thận và creatinin máu [2]).
Lấy 1ml máu tĩnh mạch vào ống nghiệm có chống đông Edta phân tích chỉ số HbA1c. Thực hiện xét nghiệm trên máy sinh hóa tự động TC matric.
Lấy 2ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống nghiệm chống đông Edta để thực hiện tách chiết DNA tổng số.
2.4.3. Phương pháp xét nghiệm nước tiểu
Nước tiểu được lấy 4ml vào ống xét nghiệm sạch sau đó phân tích kết quả 10 thông số trên máy xét nghiệm nước tiểu Mision.
2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và PCR
* Phương pháp PCR.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) : biến tính ở 940C trong 4 phút. Sau đó biến tính ở 940C trong 1 phút ( với 35 chu kỳ)
Bước 2: (Bắt cặp, annealing – với 35 chu kỳ) gắn mồi 50 – 600C (tùy từng mồi), trong 1 phút.
Bước 3: (Kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất,
Kết thúc phản ứng ở 720C trong 10 phút. Giữ sản phẩm ở 40C.
* Phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotit.
Tách chiết DNA tổng số và phân tích đa hình đơn nucleotide: máu ngoại vi của các bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu được sử dụng để tách DNA tổng số bằng AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit theo hướng dẫn.
Mồi để nhân phân đoạn nghiên cứu được thiết kế dựa trên trình tự của gen EMLO1 đã được công bố bằng phần mềm primer 3 để nhân vùng gen rs741301.
Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn 1kb leader plus có thang chuẩn từ 100 bp đến 1 kb.
Hình 2.1 Marker 1Kb ladder plus
Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV sau đó tinh sạch sản phẩm PCR để giải trình tự, do kết quả giả trình tự bị nhiễu nên nhóm nghiên cứu đã chuyển sang phương pháp tách dòng. Để giải trình tự sản phẩm PCR của gen ELMO1, chúng tôi tiến hành tạo dòng gen bằng vector pJet1.2/blunt. Các vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli DH5α. Kết quả sau biến nạp được điện di trên gel agarose 1% cùng với thang DNA chuẩn 1kb leader.
Bảng 2.1. Mồi và vị trí phân tích đa hình trên ELMO1 gen [43]
Mồi Trình tự Vị trí
Xuôi trong 5′ATAGCAATAGATTTTATGAGGTGGTAGT 3’
rs741301 Ngược trong 5′TCATTAGTGATAACATAACCTCTGGTAG 3′
Xuôi ngoài 5′AGTCTTGAGGATGAATGAATTCTAGG 3′ Ngược ngoài 5′TGTCCTAACAATTCGTTCATGATTAATG 3′
2.4.5. Phương pháp phân tích kết quảnghiên cứu
Sử dụng phương pháp thống kê thông thường.
Các kết quả sẽ được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng bao gồm SPSS phiên bản 22.0, HWE và Mann-Whitney.