Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70- 230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dungmôi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone,
CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.
Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn [4].
Thông thường tỉ lệ khối lượng cặn chiết và silica gel nhồi cột khoảng 1:30 từ đó lựa chọn kích cỡ của cột sắc ký tùy thuộc vào lượng mẫu chất cần phân tích.
2.3.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Để dự đoán và xác định được cấu trúc hóa học của các chất người ta thưởng sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Phương pháp này được chia làm 2 loại: phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C- NMR, DEPT) và phổ cộng hưởng từ 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY)
Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên sự tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài [5], [6].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
- Số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trường bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Cường độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác J cho biết proton nào tương tác với proton nào. Số lượng tín hiệu (vạch phổ): Ứng với mỗi phân tử đã cho, các proton với cùng điều kiện xung quanh như nhau, tức là có cấu tạo hóa học như nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường như nhau; các proton có điều kiện khác nhau, tức là có cấu tạo hóa học khác nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường khác nhau. Số lượng tín hiệu trong phổ NMR cho ta biết số lượng tập hợp proton tương đương, hay là bao nhiêu “loại” proton.
Vị trí vạch phổ: Đối với số lượng tín hiệu cho ta biết trong phân tử chứa bao nhiêu loại proton thì vị trí của vạch phổ cho ta biết chúng thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc 1,…Các loại proton khác nhau thì có môi trường electron bao quanh khác nhau và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Khi xét proton riêng biệt thì proton bị che chắn đỏi hỏi cường độ từ trường ngoài cao hơn và proton bị phản chắn đòi hỏi cường độ từ trường ngoài thấp hơn để tạo ra cường độ từ trường hiệu dụng riêng khi sự hấp thụ xảy ra. Sự che chắn hay phản chắn làm cho sự hấp thụ chuyển dịch về phía trường cao hay trường thấp trong phổ NMR được gọi là độ chuyển dịch hóa học.Độ chuyển dịch hóa học ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS được gán = 0 ppm. Độ chuyển dịch hóa học của một số loại proton trong phân tử chất hữu cơ được minh họa qua Hình 2.9.