Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F1 (40,7g) Bước 1: Chuẩn bị cột
Chuẩn bị cột có đường kính 5 cm; chiều dài 50 cm đãđược rửa sạch, tráng lại cột bằng acetone sau đó sấy khô cột và lót dưới đáy một ít bông. Sử dụng cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 200 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong dung môi n-hexane
khoảng 30 phút, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí trong suốt quá trình ngâm. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 1h.
Bước 2 : Đưa chất lên cột
40,7gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F1) được hòa với CH2Cl2vừa đủ
cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 20 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.12: Cột phân đoạn F1
Bước 3: Chạy cột
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 35%). Hứng dung dịch rửa giải vào các bình nón với thể tích khoảng 80-100 mL.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi MeOH. Kết quả thu được 10 phân đoạn có kí hiệu từ F1.1 ÷ F1.10 (Bảng 3.2).
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lương (g) 1 1÷4 50mLCH2Cl2/n-Hexane 0% 100mL CH2Cl2/n-Hexane 2% 150mL CH2Cl2/n-Hexane 10% F1.1 1,5609 2 5÷6 150mL CH2Cl2/n-Hexane 10% F1.2 0,7773 3 7÷19 700mL CH2Cl2/n-Hexane 10% 400mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.3 14,5491 4 20÷32 1200mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.4 6 5 33÷39 550mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.5 0,5237 6 40÷48 700mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.6 0,66 7 49÷52 320mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.7 0,1259 8 53÷59 330mL CH2Cl2/n-Hexane 20% 250mL CH2Cl2/n-Hexane 30% F1.8 0,8578 9 60÷66 600mL CH2Cl2/n-Hexane 30% F1.9 1,3322 10 67÷77 650mL CH2Cl2/n-Hexane 30% 500mL CH2Cl2/n-Hexane 35% F1.10 10,6925 Hình 3.13: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1.6.1÷F1.6.10
Từ phân đoa ̣n F1.6, sử dụng cột có đường kính 2 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 30 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 0,66 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F1.6) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem
trộn với khoảng 0,7 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.14: Cột silica gel FPLH F1.6
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane gradient 0%- 100%. Hứng dung dịch rửa giải khoảng5-10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 10 phân đoạn kí hiệu F1.6.1-F1.6.10.
Gộp 2 phân đoạn nhỏ F1.6.5 và F1.6.6 tiếp tục tiến hành chạy cột, sử dụng cột có đường kính 1 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 25 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 0,078 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F1.6.5+6) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 0,2 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.15: Cột silica gel FPLH F1.6.5+6
Tiến hành rửa giải bằng hê ̣ dung môi CH2Cl2/n-hexane gradient 0%- 100% , hứng dung dịch rửa giải khoảng 5-10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn kí hiệu F(1.6.5+6).1-F(1.6.5+6).4.
Từ phân đoạn FPLH F(1.6.5+6).4 có khối lượng 0,022 gam, tiến hành TLC điều chế trong hệ dung môi 20 mL (CH2Cl2/n-Hexane 20%)x5 thu được 8 mg chất FH8 dướ i da ̣ng chất dầu, không màu. Quá trình phân lập chất FH8
từ cặn n-Hexane cây Trâu cổ được trình bày trên Hình 3.17.
Hình 3.17: Sơ đồ phân lập hợp chất FH8
Hợp chất FH8 hiện màu dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và hiện
Hình 3.18: Hình ảnh chất FH8 và sắc ký đồ TLC
Trên sắc ký lớp mỏng của FH8 xác định được giá trị Rf = 0,50
(CH2Cl2/n-Hexane 40:60).
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FH8
Hợp chất FH8 được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và phổ khối lượng tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Từ dữ kiện phổ đo được cho phép xác định cấu trúc của hợp chất FH8.
Hình 3.20: Phổ ESI-MS của FH8
Phổ khối lượng ESI-MS của FH8 cho pic ion phân tử proton hóa [M
+H]+ = 431 phù hợp với CTPT C29H50O2, M=430.
Phân tích phổ 13C-NMR cùng với phổ DEPT của FH8 cho thấy phân tử FH8 có 29 carbon; trong đó có 8 nhóm methyl, 11 nhóm methylene, 3 nhóm
Hình 3.22: Phổ DEPT của FH8
Tín hiệu của 8 nhóm methyl còn được khẳng định trên phổ 1H-NMR của
J=7,0 Hz; CH3-13’+CH3-C12’); 0,85 (d, J=8,0 Hz, CH3-C8’); 0,84 (d, J=6,5 Hz, CH3-C4’).
Hình 3.26: Phổ 1H-NMR giãn rộng (3) của FH8
Phân tích phổ HSQC cho phép xác định được các carbon và proton liên kết trực tiếp với nhau.
Hình 3.27: Phổ HSQC của FH8
Trên phổ COSY của FH8 xác định được tương tác của H-4 (H 2,60; t;
Hình 3.28: Phổ COSY của FH8
Trên phổ HMBC của FH8 xác định được tương tác của OH-5 (H 4,19;
Hình 3.29: Phổ HMBC của FH8
Như vậy căn cứ dữ liệu phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, 2 chiều và so sánh với tài liệu tham khảo [11] cho phép xác định FH8
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp đã thu được các kết quả như sau:
- Đã điều chế được 97,1 gam cặn dịch chiết n-Hexane của cây Trâu cổ.
Khảo sát TLC cặn dịch chiết n-Hexane của cây Trâu cổ và lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-HexaneEtOAc/CH2Cl2 và MeOH/CH2Cl2 để phân tách cặn dịch chiết n-Hexane thành 9 phân đoạn nhỏ F1-F9.Từ phân đoạn nhỏ F1 đã phân tách thành 10 phân đoạn nhỏ F1.1-F1.10. Từ phân đoạn F1.6 phân tách thành 10 phân đoạn nhỏ F1.6.1-F1.6.10. Gộp phân đoạn F1.6.5 và F1.6.6 tiếp tục phân tách thành 4 phân đoạn nhỏ hơn là F(1.6.5+6).1-F(1.6.5+6).4. Từ phân đoạn F(1.6.5+6).4 tiến hành bản mỏng điều chế đã phân lập được hợp chất -Tocopherol (FH8).
- Cấu trúc của hợp chất FH8 được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, 2 chiều và phổ khối lượng.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất thiên nhiên từ các bộ phận khác của cây Trâu cổ.
- Khảo sát hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được từ cây Trâu cổ. - Lựa chọn một số hợp chất có hàm lượng cao để tiến hành chuyển hóa và khảo sát hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.1155- 1173.
[2]. Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium -Quyển 1. NXB Khoa học Tự nhiên và Công
nghệ, Hà Nội.
[3]. Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB
Thời Đại, tr.75-77.
[4]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
[5]. Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình cơ sở hóa học hữu cơ,
Tập 1, NXB Đai học sư phạm.
[6]. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, Tập 1, NXB
Giáo dục Việt Nam.
[7]. Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học một số phân
đoạn dịch chiết n-Hexane lá cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm (Moraceace) trên địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp ngành sư
phạm hóa học-Trường Đại Học Hùng Vương, Phú Thọ.
[8]. http://suckhoe24h-7.blogspot.com/2015/02/cay-trau-co-chua-benh.html
Tài liệu Tiếng Anh
[9]. Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012), “Ficus
carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects”, International Journal of Pharmaceutical and
[10]. B.S. Furniss,A.J. Hannaford, P.W.G. Smith, A.R. Tatchell (1989), Text
book of practical organic chemistry, Longman Scientific Technical,
New York.
[11]. Nicholas W. Krueger (2017), The synthesis and reactivity of Vitamin E
quinones, The thesis of master of science, Brock University, Ontario.
[12]. Natália Maria Noronha, Grazielle Esteves Ribeiro, Ingridy Simone Ribeiro, Marcos José Marques, Luiz Felipe Leomil Coelho, and Jorge Kleber Chavasco (2014), “Phytochemical profile and antioxidant and antimicrobial activities of hydroethanolic extracts of Ficus pumila”. African Journal of Microbiology Research, 8(28), pp. 2665-2671.
[13]. Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2007), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumilaL.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427.
[14]. http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ay/c4ay02196g/unaut h#!divAbstract
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
SINH VIÊN THỰC HIỆN