0.90 1.83 3.51 Br 0 1 2 3 4 PPM Hình 2.11: Phổ 1H-NMR của 1-bromopropane
Phổ cộng hưởng từ nhân carbon-13 (13C-NMR):
Phổ 13C-NMR cho biết nhiều loại thông tin trực tiếp về khung carbon mà không có proton gắn với nó.
Số lượng tín hiệu trên phổ này cho biết có bao nhiêu nhóm carbon trong phân tử.
Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa, môi trường electron bao quanh mỗi carbon [6].
Hình 2.12: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13
O O 1 2 3 4 6 5 7
Hình 2.13: Phổ DEPT của ethyl crotonate
Trên phổ DEPT-90, chỉ xuất hiện tín hiệu các nhóm CH ở phía bên trên; còn trên phổ DEPT-135; phía trên xuất hiện tín hiệu các nhóm CH, CH3; phía dưới là tín hiệu các nhóm CH2. Cacbon bậc 4 (C không liên kết với H) không xuất hiện tín hiệu trên phổ DEPT. Phổ DEPT thường được dùng để hỗ trợ phân tích phổ Cacbon-13-NMR của hợp chất hữu cơ.
Phổ COSY (1H-1H COSY):
Phổ COSY cho tín hiệu của các proton ở gần nhau (geminal, vicinal) tương tác với nhau từ đó xác định được các chuỗi liên kết trong phân tử.
Hình 2.14: Phổ 1H-1H COSY của N,N-Dimethylacetamide Dimethylacetamide
Phổ 1H-1H COSY của N,N-Dimethylacetamide được minh họa ở hình 2.14. Trên hình quan sát được các proton CH3ở N tương tác với nhau.
HSQC:
Phổ HSQC cho tín hiệu tương tác của các proton và carbon liên kết trực tiếp với nhau; từ đó xác định được các carbon tương ứng với proton trong các nhóm CH3, CH2, CH [6]. Ví dụ phổ HSQC như trong Hình 2.15.
Hình 2.15: Phổ HSQC của ethylbenzene
HMBC:
Phổ HMBC cho biết tín hiệu tương tác xa giữa proton và carbon cách nhau 2 hoặc 3 liên kết (2J, 3J). Đây là một loại phổ đặc biệt quan trọng giúp gắn kết các mảnh cấu trúc đặc trưng với nhau từ đó xây dựng cấu trúc phẳng của phân tử. Phổ HMBC của ethylbenzene được thể hiện trên Hình 2.16 cho thấy tương tác giữa H-1 với C-2, C-3; H-2 với C-1, C-3, C-4+8.
Hình 2.16: Phổ HMBC của ethylbenzene 2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng 2.3.4 Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối lượng (MS-Mass Spectrum) dựa trên sự ion hóa các phân tử. Các ion được phân tách dựa trên tỉ lệ khối lượng/điện tích (m/z). Một số kỹ thuật được sử dụng để ion hóa phân tử gồm phương pháp EI (Electron Impact-va chạm điện tử), ESI (Electrospray Impact-phun mù điện tử) [5], [6].
Phương pháp EI thường áp dụng cho các hợp chất có phân tử khối nhỏ và phân tử sẽ bị ion hóa rồi phân tách thành các mảnh ion nhỏ hơn. Ví dụ, hợp chất ethylbenzene có M = 106; trên phổ EI-MS (Hình 2.17) cho pic M+m/z=
Hình 2.17: Phổ EI-MS của ethylbenzene
Phương pháp ESI thường áp dụng cho các hợp chất có phân tử khối lớn hơn và thu trên phổ đồ cho tín hiệu các ion giả phân tử như [M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+, [M-H2O+H]+, …
5,7,2',4',5'-Pentahydroxyflavone [14]
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane cây Trâu cổ 3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane cây Trâu cổ
Sau khi thu hái,lá cây Trâu cổ sau được rửa sạch, để khô nước rồi đem thái nhỏ. Phơi mẫu cây trong điều kiện không có nắng mặt trời trực tiếp.
Hình 3.1: Mẫu Trâu cổ sau khi phơi khô
Khi đã phơi khô,xay nhỏ mẫu lá cây thu được 5,8 kg. Cho mẫu lá Trâu cổ vào 4 bình thủy tinh dung tích 5L.
Đầu tiên là ngâm mẫu trong dung môi n–Hexane, đổ dung môi ngập mẫu (tổng số 20 L n-hexane).
Ngâm lần thứ nhất: Sau 24h tiến hành lọc lấy dịch chiết n-hexane qua
vải lọc lần 1 và giấy lọc lần 2.
Hình 3.3: Quá trình lọc dung dịch qua vải
Gộp các dịch chiết thu được, đem đi cô quay dưới hệ thống cất quay chân không có áp suất giảm ở nhiệt độ 44°C,tốc độ quay trung bình 205 vòng/phút để thu được cặn dịch chiết n-hexane lá cây Trâu cổ.
Hình 3.5:Quay khô dung dịch bằng máy cất quay
Dung môi n-hexane thu hồi để ngâm tiếp và bổ sung thêm cho ngập mẫu. Tiến hành lặp lại tổng số 5 lần ngâm mẫu. Mỗi lần ngâm qua đêm 24h. Sau các quá trình ta thu được 97,1 gam cặn n-hexane lá cây Trâu cổ (kí hiệu
FPLH).Quá trình ngâm chiết lá cây Trâu cổ được trình bày qua Hình 3.6.
Hình 3.7: Cặn n-hexane lá cây Trâu cổ
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ
3.1.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn dịch chiết n- hexane của lá cây Trâu cổ hòa tan trong hỗn hợp CH2Cl2 - n-Hexane. Pha hệ dung môi (2 mL) rồi đổ vào bình triển khai sắc ký. Sử dụng bản mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm. Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
+ Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 366 nm. Phun thuốc thử Ce(SO4)2, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Mỗi vệt tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong cặn chiết, đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel.
+ Kết quả sắc ký đồ:
(I): CH2Cl2 /n-Hexane (10%) (II): CH2Cl2 /n-Hexane (20%) (III): CH2Cl2 /n-Hexane (25% (IV): CH2Cl2 /n-Hexane (35%) (V): CH2Cl2/n-Hexane (75%) (VI): EA/Hx(5%)
(VII): EA/Hx(25%) (VIII): EA/ CH2Cl2 (10%) (IX):MeOH/ CH2Cl2 (5%)
Các bản mỏng sau khi được triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó phun thuốc thử Ce(SO4)2 thu được kết quả tương ứng như sau (Hình 3.8):
Kết quả so sánh cho thấy các chất được khai triển tốt nhất ở hệ dung môi
(V). Nhiều vệt chất hiện màu ở đèn tử ngoại với bước sóng =366 nm (một số
vệt chất hiện màu ở cả bước sóng 254nm) và thuốc thử Ce(SO4)2.
UV-366 Ce(SO4)2
Hình 3.9: TLC cặn n-HexaneTrâu cổ với hệ dung môi (VII)
Do đó, lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n-Hexane của cây Trâu cổ.
3.2.1 Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Dùng cột có đường kính 10 cm, chiều dài 50 cm đã được rửa sạch, tráng lại cột bằng acetone sau đó sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 150 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-Hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Giai đoạn 2: Đưa chất lên cột
Cặn dịch chiết n-Hexane có khối lượng là 97,1 gam (kí hiệu FPLH) được hòa tan với dung môi n-Hexane vừa đủ cho tan hết, sau đó đem trộn với
khoảng 90 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy cất quay chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ sao cho phần silica gel phân bố đều vào cột như Hình 3.10.
Hình 3.10: Cột tổng silica gel cặn n-Hexane
Giai đoạn 3: Chạy cột tổng
Qúa trình chạy cột tổng được tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 100%).
Dung dịch rửa giải được hứng vào mỗi bình tam giác có thể tích khoảng 80-100 mL.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vệt chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi MeOH. Kết quả thu được 9 phân đoạn chính có kí hiệu từ F1-F9 (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng n-Hexane
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lượng (gam) 1 1÷12 1200mL CH2Cl2 /n-Hexane 15% F1 40,7 2 13÷20 800 mL CH2Cl2 /n-Hexane 15% F2 4,8 3 21÷59 3300mL CH2Cl2 /n-Hexane 15% 600mL CH2Cl2 /n-Hexane 20% F3 22,8 4 60÷89 400mL CH2Cl2 / n-Hexane 20% 1000 mL CH2Cl2/ n-Hexane 25% 1000 mL CH2Cl2/ n-Hexane 35% 600mL CH2Cl2/ n-Hexane 45% F4 10,3 5 90÷118 400mL CH2Cl2 / n-Hexane 45% 1000 mL CH2Cl2/ n-Hexane 25% 1000 mL CH2Cl2/ n-Hexane 55% 500 mL CH2Cl2/ n-Hexane 60% F5 5,8 6 119÷132 500 mL CH2Cl2/ n-Hexane 60% 900 mL CH2Cl2/ n-Hexane 75% F6 4,8 7 133÷140 100 mL CH2Cl2/ n-Hexane 75% 700 mL CH2Cl2/ n-Hexane 85% F7 3,0 8 141÷166 300 mL CH2Cl2/ n-Hexane 85% 1000 mL CH2Cl2/ n-Hexane 95% 1300 mL CH2Cl2/ n-Hexane 100% F8 3,0 9 167÷177 1100 ml CH2Cl2/ n-Hexane 100% F9 1,9
Các phân đoạn F1-F9 được khảo sát lại TLC với các hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane và MeOH/CH2Cl2 cho kết quả như trong Hình 3.11.
(I) (II)
Hình 3.11: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F9
Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ phân đoạn nhỏ F1 (40,7g) Bước 1: Chuẩn bị cột
Chuẩn bị cột có đường kính 5 cm; chiều dài 50 cm đãđược rửa sạch, tráng lại cột bằng acetone sau đó sấy khô cột và lót dưới đáy một ít bông. Sử dụng cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 200 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong dung môi n-hexane
khoảng 30 phút, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí trong suốt quá trình ngâm. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 1h.
Bước 2 : Đưa chất lên cột
40,7gam cặn chiết n-Hexane (kí hiệu F1) được hòa với CH2Cl2vừa đủ
cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 20 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.12: Cột phân đoạn F1
Bước 3: Chạy cột
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (0% - 35%). Hứng dung dịch rửa giải vào các bình nón với thể tích khoảng 80-100 mL.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi MeOH. Kết quả thu được 10 phân đoạn có kí hiệu từ F1.1 ÷ F1.10 (Bảng 3.2).
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lương (g) 1 1÷4 50mLCH2Cl2/n-Hexane 0% 100mL CH2Cl2/n-Hexane 2% 150mL CH2Cl2/n-Hexane 10% F1.1 1,5609 2 5÷6 150mL CH2Cl2/n-Hexane 10% F1.2 0,7773 3 7÷19 700mL CH2Cl2/n-Hexane 10% 400mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.3 14,5491 4 20÷32 1200mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.4 6 5 33÷39 550mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.5 0,5237 6 40÷48 700mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.6 0,66 7 49÷52 320mL CH2Cl2/n-Hexane 20% F1.7 0,1259 8 53÷59 330mL CH2Cl2/n-Hexane 20% 250mL CH2Cl2/n-Hexane 30% F1.8 0,8578 9 60÷66 600mL CH2Cl2/n-Hexane 30% F1.9 1,3322 10 67÷77 650mL CH2Cl2/n-Hexane 30% 500mL CH2Cl2/n-Hexane 35% F1.10 10,6925 Hình 3.13: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1.6.1÷F1.6.10
Từ phân đoa ̣n F1.6, sử dụng cột có đường kính 2 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 30 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 0,66 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F1.6) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem
trộn với khoảng 0,7 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.14: Cột silica gel FPLH F1.6
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 /n-Hexane gradient 0%- 100%. Hứng dung dịch rửa giải khoảng5-10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 10 phân đoạn kí hiệu F1.6.1-F1.6.10.
Gộp 2 phân đoạn nhỏ F1.6.5 và F1.6.6 tiếp tục tiến hành chạy cột, sử dụng cột có đường kính 1 cm, chiều dài là 50 cm, được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt. Cân 25 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h. Lấy 0,078 gam cặn chiết n-hexane (kí hiệu FPLH F1.6.5+6) được hòa với hỗn hợp CH2Cl2 /n-Hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 0,2 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Hình 3.15: Cột silica gel FPLH F1.6.5+6
Tiến hành rửa giải bằng hê ̣ dung môi CH2Cl2/n-hexane gradient 0%- 100% , hứng dung dịch rửa giải khoảng 5-10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi MeOH thu được 4 phân đoạn kí hiệu F(1.6.5+6).1-F(1.6.5+6).4.
Từ phân đoạn FPLH F(1.6.5+6).4 có khối lượng 0,022 gam, tiến hành TLC điều chế trong hệ dung môi 20 mL (CH2Cl2/n-Hexane 20%)x5 thu được 8 mg chất FH8 dướ i da ̣ng chất dầu, không màu. Quá trình phân lập chất FH8
từ cặn n-Hexane cây Trâu cổ được trình bày trên Hình 3.17.
Hình 3.17: Sơ đồ phân lập hợp chất FH8
Hợp chất FH8 hiện màu dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và hiện
Hình 3.18: Hình ảnh chất FH8 và sắc ký đồ TLC
Trên sắc ký lớp mỏng của FH8 xác định được giá trị Rf = 0,50
(CH2Cl2/n-Hexane 40:60).
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FH8
Hợp chất FH8 được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và phổ khối lượng tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Từ dữ kiện phổ đo được cho phép xác định cấu trúc của hợp chất FH8.
Hình 3.20: Phổ ESI-MS của FH8
Phổ khối lượng ESI-MS của FH8 cho pic ion phân tử proton hóa [M
+H]+ = 431 phù hợp với CTPT C29H50O2, M=430.
Phân tích phổ 13C-NMR cùng với phổ DEPT của FH8 cho thấy phân tử FH8 có 29 carbon; trong đó có 8 nhóm methyl, 11 nhóm methylene, 3 nhóm
Hình 3.22: Phổ DEPT của FH8
Tín hiệu của 8 nhóm methyl còn được khẳng định trên phổ 1H-NMR của
J=7,0 Hz; CH3-13’+CH3-C12’); 0,85 (d, J=8,0 Hz, CH3-C8’); 0,84 (d, J=6,5 Hz, CH3-C4’).
Hình 3.26: Phổ 1H-NMR giãn rộng (3) của FH8
Phân tích phổ HSQC cho phép xác định được các carbon và proton liên