2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm, điều kiện nghiên cứu
Đối tƣợng: Giống hoa cúc Mai Vàng.
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu này là giống hoa cúc từ trƣờng Đại Học Hùng Vƣơng cung cấp
Địa điểm nghiên cứu: Tại nhà lƣới và phòng thí nghiệm Sinh học trƣờng Đại Học Hùng Vƣơng
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Các đặc điểm hình thái (thân, lá, hoa) của giống hoa cúc giống mai vàng trồng tại Phú Thọ.
- Các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh của giống hoa cúc dƣới ảnh hƣởng của axit Salicylic.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái (thân, lá, hoa) của giống hoa cúc mai vàng trồng tại Phú Thọ mai vàng trồng tại Phú Thọ
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của axit Salicylic tới các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh của cây hoa cúc
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và đánh giá một số chỉ tiêu sinh trưởng
- Đặc điểm thực vật điển hình: lá, thân, hoa. Mẫu vật nghiên cứu phân loại là rễ, thân, lá, hoa của cây hoa cúc đƣợc thu thập và xử lý theo đúng quy trình kỹ thuật.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của axit Salicylic đến các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh của cây hoa cúc
- Ảnh hƣởng của axit salicylic đến các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh của cây hoa cúc:
+ TN1: Ảnh hƣởng của axit salicylic (xử lí trƣớc cắt cành) đến các chỉ tiêu sinh lí của cây hoa cúc:
SA ở các nồng độ 0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mM đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Mỗi công thức thí nghiệm gồm ba lần lặp lại, mỗi lần gồm 10 cành hoa. SA ở nồng độ thí nghiệm đƣợc phun lên bề mặt lá, sử dụng 200 ml dung dịch cho mỗi lần nhắc lại. Các chỉ tiêu đƣợc phân tích sau 5; 10 và 15 ngày sau xử lí. Theo dõi các chỉ tiêu sinh lí nhƣ hàm lƣợng sắc tố quang hợp, huỳnh quang diệp lục, anthocyanin, hoạt độ catalase, hàm lƣợng prolin, thời gian sống của cành hoa ở các công thức thí nghiệm.
+ TN2: Ảnh hƣởng của axit salicylic (xử lí sau cắt cành) đến các chỉ tiêu sinh lí của hoa cúc cắt cành:
SA ở các nồng dộ 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 và 2,0 mM đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Mỗi công thức thí nghiệm gồm ba lần lặp lại, mỗi lần gồm 10 cành hoa. SA ở nồng độ thí nghiệm đƣợc phun lên bề mặt lá, sử dụng 200 ml dung dịch cho mỗi lần nhắc lại. Các chỉ tiêu đƣợc phân tích sau 1,2,3,4,5 ngày sau xử lí. Theo dõi các chỉ tiêu sinh lí nhƣ hàm lƣợng sắc tố quang hợp, huỳnh quang diệp lục, anthocyanin, hoạt độ catalase, hàm lƣợng prolin, thời gian sống của cành hoa ở các công thức thí nghiệm.
* Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh
- Xác định đặc điểm sinh lí, hóa sinh:
+ Xác định khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô: mẫu đƣợc xác định khối lƣợng tƣơi bằng cân kĩ thuật (d = 0,0001). Khối lƣợng khô đƣợc xác định bằng cân kĩ thuật sau khi đã sấy mẫu ở 80°C trong 24 giờ đến khối lƣợng không đổi.
Dựa trên phản ứng giữa prolin và dung dịch ninhydrin trong axit tạo hợp chất màu vàng, hấp thụ bƣớc sóng đặc trƣng 520nm.
Cân 0,2g mẫu lá nghiền kĩ, thêm 2ml dung dịch axit sulphosalicylic 3% ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch lọc. Lấy 1ml dịch chiết cho vào bình, thêm 1ml axit acetic và 1ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nƣớc nóng 100oC trong thời gian 1 giờ sau đó ủ nƣớc đá 5 phút. Bổ sung vào bình phản ứng 2ml toluen, lắc đều (15 – 20 giây). Đợi ở nhiệt độ phòng cho tới phản ứng có màu. Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem đo OD520nm bằng máy đo quang phổ.
Hàm lƣợng prolin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn prolin và tính toán theo công thức:
Prolin (g/g)=
X(g/ml)xV(ml)xdf W(g)
Trong đó: X – giá trị OD520 của mẫu; V - thể tích dịch chiết (= số ml toluen); df – hệ số pha loãng (trƣờng hợp này là 5); w – khối lƣợng mẫu.
+ Định lƣợng diệp lục, carotenoid bằng phƣơng pháp quang phổ (Mã et al., 2013).
Hàm lƣợng sắc tố quang hợp đƣợc đo bằng máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV(Thermo Electron Corporation, Mỹ).
Cân 0,2 g lá cây đem nghiền trong cối xứ với 5 ml axeton 80%. Sau khi lá đã đƣợc nghiền nhuyễn, thêm 5 ml axeton 80% vào tiếp tục nghiền. Sau đó đổ dung dịch nghiền đƣợc sang ống đong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại đổ vào ống đong đó làm sao cho đạt đƣợc đủ10 ml.
Sau đó chuyển dung dịch từ ống đong sang ống li tâm để li tâm với tốc độ 4000vòng/phút trong thời gian 5 phút. Sau khi li tâm, chuyển dung dịch nổi sang ống nghiệm đo OD của dịch chiết ở các bƣớc sóng 663nm, 647nm và
470nm trên máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV(Thermo Electron Corporation, Mỹ).
Nồng độ sắc tố quang hợp đƣợc tính theo công thức: Ca = 12,7xE663 – 2,69xE647
Cb = 22,9xE647 – 4,68xE663 Ca+b = 8,02xE663 + 20,3xE647
Cx+c = (1000xE470 - 1,82xCa - 85,02xCb)/198
Trong đó: Ca, Cb, Ca+b, Cx+clà các trị số đo nồng độ (mg/l) tƣơng ứng của các Chl a, Chl b, Chl a+b và Car.
Hàm lƣợng sắc tố (mg/g lá tƣơi) đƣợc tính theo công thức sau:
A(mg/g lá tƣơi) = CxV Px1000 Trong đó: A: Hàm lƣợng sắc tố (mg/g lá tƣơi). C: Nồng độ sắc tố (mg/l)
V: Thể tích dịch chiết (ml) P: Khối lƣợng mẫu tƣơi (g)
+ Xác định huỳnh quang diệp lục bằng máy đo huỳnh quang Chlorophyll Fluorometer OS-30 [52].
Huỳnh quang chlorophyll đƣợc đo trực tiếp từ lá của ít nhất năm cây khác nhau, mỗi cây đo một lá bằng máy OS30p+ (OPTI-SCIENES, Mỹ) theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Nguyễn Văn Mã và nnk [52].
Máy đo xác định các chỉ tiêu: F0: Huỳnh quang tối thiểu. Fm: Huỳnh quang cực đại.