CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiê ̣m
- Môi trường nền sử dụng để nhân chồi: MS + 100 ml/l nước dừa + 30 g/l saccarozơ + 6 g/l agar + 100 g/l khoai tây + 0,5 g/l than hoạt tính.
- Môi trường nền sử dụng để tạo rễ: ½ MS + 100 ml/l nước dừa + 30 g/l saccarozơ + 6 g/l agar + 100 g/l khoai tây + 0,5 g/l than hoạt tính.
- Thí nghiê ̣m 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến hệ số nhân,
chiều cao và chất lượng chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo. + Vật liệu sử dụng: Chồi in vitro có chiều cao 0,3 – 1 cm. + Công thức thí nghiệm được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, Kinetin
Tên công thức Nồng độ của BAP và Kinetin BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) ĐC 0 0 BAP0,5 0,5 0 BAP1 1 0 BAP1,5 1,5 0 BAP1,75 1,75 0 BAP20 2 0 BAP2,25 2,25 0 BAP2,5 2,5 0 BAP3 3 0 Ki0,5 0 0,5 Ki1 0 1 Ki1,5 0 1,5 Ki20 0 2 Ki2,5 0 2,5
+ Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắ c lại gồ m 5 mẫu + Chỉ tiêu đánh giá: Hệ số nhân chồi, chiều cao chồi/chồi, số lá/chồi. + Thời gian thu thập: Sau 8 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiê ̣m 2 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng
ra rễ của cây chồi cây in vitro loài lan Ý Thảo
+ Vật liệu sử dụng: Chồi in vitro có chiều cao 2-3cm. + Công thức thí nghiệm được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiê ̣m nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và IBA đến
Tên công thức Nồng độ của NAA và IBA NAA (mg/l) IBA (mg/l) ĐC 0 0 NAA05 0,5 0 NAA1 1 0 NAA15 1,5 0 NAA20 2 0 NAA25 2,5 0 IBA0 0 0 IBA05 0 0,5 IBA1 0 1 IBA15 0 1,5 IBA20 0 2 IBA25 0 2,5
+ Mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắ c lại gồ m 5 mẫu + Chỉ tiêu đánh giá: Tổng số rễ/chồi, chiều dài rễ.
+ Thời gian thu thập: Sau 8 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự phát triển của cây lan Ý thảo ở giai đoạn
ra cây dưới sự tác động của giá thể.
a. Bố trí thí nghiệm
Ngoài mục tiêu nghiên cứu mà đề tài đã đặt ra, tôi nghiên cứu thêm sự phát triển của cây lan Ý thảo ở giai đoạn ra cây trên hai giá thể là Dừa và Dớ qua một số đặc điểm sinh lí, hóa sinh như: hàm lượng sắc tố quang hợp, hoạt độ enzym catalase.
+ Sau khi qua giai đoạn luyện cây, tôi tiến hành ra cây trên hai giá thể xơ dừa và dớn, mỗi giá thể thí nghiệm gồm 10 cây, ba lần lặp lại. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
+ Sau khi trồng, cây tưới nước 2 lần/ ngày (sáng trước 9h và chiều sau 16h), mỗi lần tưới 200 ml nước (bằng ống đong 200ml) cho giá thể.
+ Tiến hành thí nghiệm kiểm tra kết quả sau 14 ngày.
b. Phương pháp xác định những đặc điểm sinh lí, hóa sinh * Hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) [11]
- Cân khoảng 0,2 g lá cây rồi nghiền trong cối xứ với 2 ml axeton 80%. Sau khi lá đã được nghiền nhuyễn, thêm 5 ml axeton 80% vào tiếp tục nghiền. Sau đó đổ dung dịch nghiền được sang ống đong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại đổ vào ống đong đó làm sao cho đạt được đủ 10ml.
- Sau đó đổ dung dịch từ ống đong sang ống li tâm để li tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút.
- Sau khi li tâm đem dung dịch đo trên máy quang phổ ở các bước sóng 663nm, 647nm và 470nm.
* Hoạt tính enzym catalase [11]
- Cân khoảng 0,2 g mẫu, sau đó bổ sung một ít CaCO3 và cho vào cối sứ nghiền nhỏ.
- Cho 10 ml đệm pH = 7 vào cối, khuấy đều và đổ vào ống đong 100 ml. Tráng lại cối bằng đệm pH = 7 hai lần và đổ vào ống đong.
- Dẫn đệm vào ống đong đến 40ml.
- Cho vào bình đựng có đánh số thứ tự. Lắc bằng máy lắc trong 20 phút. - Lọc bằng bông sau đó lọc bằng giấy lọc vào bình tam giác đã được đánh số thứ tự sau đó thu được dịch chiết.
- Ở mỗi mẫu lấy 10 ml dịch chiết enzym cho vào bình đối chứng, 10 ml dịch chiết cho vào bình thí nghiệm đã được đánh số thứ tự.
+ Đối với bình đối chứng: Đặt bình dịch triết vào nồi và đun cách thủy trong vòng 6 phút. Sau đó để nguội, tiếp tục cho vào bình đối chứng 10 ml dung dịch H2O2 0,1 % rồi đưa vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 20 phút.
Sau đó đưa ra ngoài, nhỏ vào 5ml dung dịch H2SO4 10 % rồi chuẩn độ bằng KMnO4 0,01 N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.
+ Đối với bình thí nghiệm: Nhỏ vào bình 10ml dung dịch H2O2 0,1% rồi cho ngay vào tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 20 phút. Sau đó đưa ra ngoài, nhỏ vào 5ml dung dịch H2SO4 10% rồi chuẩn độ bằng KMnO4 0,01 N đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.