2.3.4.2 Phổ cộng hưởng từ nhân carbon-13 (13C-NMR)
Phổ 13C-NMR được sinh ra theo cách giống như phổ 1H-NMR [5].
Đồng vị 13C chỉ chiếm 1,1% hàm lượng carbon thiên nhiên, nhưng độ nhạy của phổ kế hiện đại đủ để đo phổ 13C-NMR.
Phổ 13C-NMR cho nhiều loại thông tin như 1H-NMR những thông tin trực tiếp là về khung carbon mà không có proton gắn với nó.
- Số lượng tín hiệu cho biết có bao nhiêu nhóm carbon khác nhau hay nhóm carbon tương đương khác nhau có trong phân tử.
- Sự tách vạch tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu hiđro găn với mỗi carbon - Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa(sp, sp2,sp3), môi trường electron bao quanh mỗi carbon đối với nhau, carbon gần bên cạnh hay các nhóm chức.
Hình 2.8. Minh họa phổ 13C-NMR.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chất từ cặn dịch chiết CH2Cl2 3.1 Phân lập chất từ cặn dịch chiết CH2Cl2
3.1.1 Điều chế cặn dịch chiết CH2Cl2 củ cây Gai
Mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40 – 500C. Sau khi phơi khô thu được 3,5 kg mẫu củ cây Gai.
Hình 3.1. Củ cây Gai được thái nhỏ, phơi trong bóng mát
Củ cây Gai sau khi làm khô được nghiền nhỏ đem ngâm chiết với các dung môi khác nhau:
Quy trình ngâm chiết: Ngâm chiết với dung môi CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng 5 lần, mỗi lần ngâm trong 24 giờ. Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được căn chiết CH2Cl2 (kí hiệu BNFD), khối lượng cặn thu được m = 31,8 (gam). Sau đó tiếp tục ngâm chiết mẫu cây với MeOH, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn dịch chiết MeOH của cây Gai.
(I) (II)
(III) (IV)
Hình 3.2. Quá trình ngâm chiết điều chế cặn CH2Cl2
3.1.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết CH2Cl2 từ cây Gai
3.1.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn dịch chiết CH2Cl2
triển khai sắc ký. Sử dụng bản mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm. Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
+ Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 366 nm. Nhúng thuốc thử Ce(SO4)2, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Mỗi vết tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong cặn chiết, đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silica gel.
+ Kết quả sắc ký đồ:
Hệ các dung môi được triển khai gồm:
(I): EtOAc /n-Hexane 10%
(II): EtOAc /n-Hexane 15%
(III): Acetone/ n-Hexane 10%
(IV): Acetone/ n-Hexane 15%
(V): CH2Cl2/n-Hexane 30%
(VI): CH2Cl2/n-Hexane 50%
Các bản mỏng sau khi được triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó phun thuốc thử Ce(SO4)2 thu được kết quả tương ứng như sau (Hình 3.3):
(I) (II) (III) (IV) (V) (VI)
Hình 3.3. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết CH2Cl2 của cây Gai
Kết quả so sánh cho thấy các chất được khai triển tốt ở các hệ dung môi
(V) và (VI). Các vệt chất hiện màu ở thuốc thử Ce(SO4)2 rõ ràng, khả năng tách các chất cao (Hình 3.4).
(V) (VI)
Các giá trị Rr của các vệt chất với hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane (50%) được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng
STT Rf Ce(SO4)2
UV
254 nm 366 nm
1 0,10 Xanh đen Nâu (-)
2 0,22 Xanh đen Nâu Huỳnh quang xanh 3 0,33 Xanh đen (-) (-)
4 0,50 Xanh đen (-) (-) 5 0,63 Xanh đen (-) (-)
6 0,90 Xanh đen Nâu Huỳnh quang xanh (-): không hiện
Do đó, lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn CH2Cl2 của cây Gai.
3.1.2.2. Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Cột có đường kính 10 cm, chiều dài 50 cm được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 300 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3 giờ.
Giai đoạn 2: Đưa chất lên cột
31,8 gam cặn chiết CH2Cl2 (kí hiệu BNFD) được hòa với n-hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 100 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu xanh nâu.
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.5).
Hình 3.5. Cột tổng silica gel cặn CH2Cl2
Giai đoạn 3: Chạy cột tổng
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/n-hexane gradient (0-90%) Hứng dung dịch rửa giải khoảng 80÷100 mL vào mỗi bình nón.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2. Kết quả thu được 8 phân đoạn chính có kí hiệu từ F1÷F8 (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng CH2Cl2
STT Bình
gộp Dung môi rửa giải
Phân đoạn Khối lượng (gam) 1 1÷15 500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 0% 1000 mL CH2Cl2 /n-Hexane 10% F1 3,2g
STT Bình
gộp Dung môi rửa giải
Phân đoạn Khối lượng (gam) 2 16÷30 1300 mL CH2Cl2 /n-Hexane 20% F2 1g 3 31÷51 500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 30% 500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 40% 1500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 50% F3 2,4g 4 52÷70 500 mL EtOAc /n-Hexane 60% 1000 mL CH2Cl2 /n-Hexane 70% 500 mL CH2Cl2 /n-Hexane 80% F4 2,6g 5 71÷93 1000 mL CH2Cl2 /n-Hexane 90% 800 mL CH2Cl2 /n-Hexane 100% F5 0,6g 6 94÷99 Dội cột MeOH/ CH2Cl2 500 mL MeOH /CH2Cl2 6% F6 5,7g 7 100÷107 800 mL MeOH /CH2Cl2 10% F7 6,8g 8 108÷112 1000 mL MeOH /CH2Cl2 100% F8 0,5g
Các phân đoạn F1÷F8 được khảo sát lại TLC với các hệ dung môi MeOH /CH2Cl2 10%-(I), 50%-(II); EtOAc /n-Hexane 15%-(III); CH2Cl2/n-
Hexane 75%-(IV) cho kết quả như trong Hình 3.6.
(I) (II)
(III) (IV)
Hình 3.6. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F8
Giai đoạn 4: Phân lập các chất từ các phân đoạn nhỏ
Từ phân đoạn F3, xuất hiện kết tủa hình kim màu trắng bám lên thành bình. Thu lấy phần kết tủa, kết tinh lại trong hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane thu được 84 mg chất C2 dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Hợp chất
C2 không hiện màu nâu dưới UV-254 nm và hiện màu với thuốc thử Ce(SO4)2 (Hình 3.7). Quá trình phân lập hợp chất C2 được trình bày qua
Hình 3.8.
Hình 3.7. Hình ảnh sắc ký đồ TLC chất C2
3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập được
Hợp chất C2 được tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR. Từ dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định cấu trúc của chất. HO H H H 1 3 5 7 9 10 11 14 16 17 18 20 24 29 25 26 27 19 21 22 HO H H H 1 3 5 7 9 10 11 14 16 17 18 20 24 29 25 26 27 19 21 22 -Sitosterol Stigmasterol Hình 3.9. Cấu trúc của C2
Hợp chất C2 được so sánh TLC với hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol; kết quả thu được cho thấy C2 có Rf = 0,50 (CH2Cl2/n-Hexane 80:20) trùng với Rf của hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol (Hình 3.10).
Trên phổ 1H-NMR của C2 có tín hiệu của proton olefinic ở H 5,35 ppm (1H, m, H-6), proton của nhóm CH liên kết với oxygen ở H 3,52 ppm (1H, m, H-3). Tín hiệu 6 nhóm methyl cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR của C2 ở H 0,68 (3H, s, 18-CH3); 0,82 (3H, d, J = 7,5 Hz, 26-CH3); 0,83 (3H, J = 7,0 Hz, 27-CH3); 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz, 29-CH3); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3); 1,05 (3H, s, 19-CH3).
Trên phổ 1H-NMR còn quan sát được tín hiệu của hai proton olefinic ở
H 5,16 (1H, m, H-22); 5,02 (1H, m, H-23) đặc trưng cho liên kết đôi giữa C- 22 và C-23 trong phân tử Stigmasterol.
Đây cũng là điểm khác biệt cấu trúc duy nhất giữa Stigmasterol và - Sitosterol. Kết hợp tài liệu tham khảo [10] cho phép khẳng định C2 là hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol.
Căn cứ đường cong tích phân của các proton olefinic cho thấy tỉ lệ hai hợp chất này là -Sitosterol : Stigmasterol = 4,88:1.
3.3 Tìm hiểu con đường sinh tổng hợp C2
Quá trình sinh tổng hợp -sitosterol và stigmasterol được bắt nguồn từ phản ứng cộng của đơn vị acetyl tạo thành acetoacetate hoạt hóa. Dưới tác dụng của enzyme HMG-CoA-khử hóa (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA) khử nhóm thiocarbonyl tạo chức alcohol trong phân tử mevalonic acid [15]. Dưới tác dụng của các enzyme khác nhau hình thành đơn vị isoprene, squalene và cuối cùng tạo -sitosterol và stigmasterol.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Kết quả đề tài khóa luận tốt nghiệp đạt mục tiêu đề ra. Bộ phận củ cây Gai trên địa bàn tỉnh Phú Thọ tiếp tục được nghiên cứu thành phần hóa học:
- Đã phân lập được một hợp chất C2 đó là β-Sitosterol + Stigmasterol (tỉ lệ 4,88:1 tương ứng) từ cặn CH2Cl2 củ cây Gai.
- Cấu trúc của hợp chất C2 được xác định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, so sánh TLC với hỗn hợp chuẩn và tài liệu tham khảo. Đã tìm hiểu và giải thích con đường sinh tổng hợp C2 trong tự nhiên.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục tinh chế các phân đoạn còn lại của dịch chiết CH2Cl2 của cây Gai nhằm tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có trong loài cây này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 2, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
[2]. Trần Thị Thu Hà (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học một số phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 cây Gai (Boehmeria nivea (L) Gaud.) họ Gai
Urticaceae, Khóa luận tốt nghiệp ngành sư phạm hóa học, Trường Đại
học Hùng Vương, Phú Thọ.
[3]. Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Thời đại.
[4]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[5]. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, Tập 1, Nxb Giáo dục Việt Nam.
[6]. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2012), Hóa học hữu cơ, Tập 2, Nxb Giáo dục Việt Nam.
[7]. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng
trong hóa học, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
[8]. Cai XF, Jin X, Lee D, Yang YT, Lee K, Hong YS, Lee JH, Lee JJ (2006), “Phenanthroquinolizidine alkaloids from the roots of Boehmeria
pannosa potently inhibit hypoxia-inducible factor-1 in AGS human
gastric cancer cells”, J Nat Prod, 69, pp. 1095-1097.
[9]. Chen GQ, Liu YL, Xie Q, Li XR, Xu QM, Yang SL (2009), “Chemical constituents in roots of Boehmeria nivea”, Chin Tradit Herb Drugs, 40, pp. 683-686.
[10]. Phan Minh Giang, Nguyen Thi Minh Hang, Phan Tong Son (2005), “Constituents of Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae of Vietnam”,
Journal of Chemistry, 43 (4), pp. 489-493.
[11]. Luo YG, Li BG, Zhang GL (2001), “A new quinolizidine alkaloid from
Boehmeria siamensis”, Chin Chem Lett, 12, pp. 337-338.
[12]. Luo YG, Liu Y, Luo DX, Gao XP, Li BG, Zhang GL (2003), “Cytotoxic alkaloids from Boehmeria siamensis”, Planta Med, 69, pp. 842-845. [13]. Semwal DK, Rawat U, Semwal R, Singh R, Krishan P, Singh M, Singh
GJP (2009), “Chemical constituents from the leaves of Boehmeria
rugulosa with antidiabetic and antimicrobial activities”, J Asian Nat
Prod Res, 11, pp. 1045-1055.
[14]. WANG Jian, YANG Hong-xing, TENG Yong-zhen, YUAN Pei, TIAN Rui, LIAO Chun-bi (2011), “An Overview on the Progress of Chemical Constituents and Bioactivities of Plants in Urticaceae during 2000－
2010”, Chinese Herbal Medicines, 3(1), pp. 9-16.
[15]. Wanchai De-Eknamkul, Buppachart Potduang (2003), “Biosynthesis of b-sitosterol and stigmasterol in Croton sublyratus proceeds via a mixed origin of isoprene units”, Phytochemistry, 62, 389–398.
Xác nhận của giảng viên hướng dẫn
ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
Sinh viên