CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký là một phương pháp có thể tách riêng các loại hợp chất thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha động và pha tĩnh). Mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha , vì thế sẽ có tương tác mạnh/ yếu khác nhau đối với pha tĩnh; Hệ quả là mỗi loại hợp chất
sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau,nhờ vậy, phương pháp sắc ký có thể tách riêng được các loại hợp chất[6].
Bảng 2.1: Các loại pha động và pha tĩnh thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký
Pha động Pha tĩnh Tên gọi của kỹ thuật sắc ký
Chất lỏng Chất rắn Sắc ký lỏng- rắn( Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng)
Chất khí Chất rắn Sắc ký khí - rắn( gọi chung là sắc khí)
Chất lỏng Chất lỏng Sắc ký lỏng - lỏng (Sắc ký HPLC với cột nhồi pha đảo C-18)
Chất khí Chất lỏng Sắc ký khí – lỏng( Gọi chung là sắc khí) 2.3.1.1Phương pháp sắc ký lớp mỏng M: Hỗn hợp chất ban đầu A, B: Các vệt chất được phân tách Hình 2.6: Minh họa sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh bao gồm các chất hấp thụ(silicagel, aluminum oxide, hoặc cellulose) dựa theo yêu cầu phân tích thường là silicagel, được trải thành lớp mỏng đồng nhất, được cố đính trên các phiến kim loại hoặc kính. Pha động là hệ một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển qua pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Trong quá trình di chuyển các chất trong mẫu thử(cấu tử) được di chuyển qua lớp mỏng, theo chiều của pha động, tuy nhiên di chuyển với tốc độ khác nhau. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên
nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn. Sau quá trình ta thu được một sắc ký đồ lớp mỏng[9].
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.
Rf = Quãngđườngdichuyểncủachất Quãngđườngdichuyểncủadungmôi Trong trường hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) = lA
l ; Rf(B) = lB
l.
Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký TLC, Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH, EtOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là vanilin.
2.3.1.2 Phương pháp sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 0,063 mm (230- 400 mesh) của hãng Merck, pha động là dung môi rửa giải, chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-
hexane/acetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.
Về nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn.