ĐC B05
B1 B15
B2 B25
Hình 3.2. Chồi cây in vitro trên các môi trường có bổ sung BAP và trên môi trường đối chứng
Về đặc điểm chồi chịu ảnh hƣởng rõ rệt của việc thay đổi nồng độ BAP. Sự sinh trƣởng chiều cao chồi đạt kết quả tốt ở nồng độ BAP 1mg/l, 1,5mg/l, 2mg/l, 2,5mg/l (B1, B15, B2, B25). Sự sinh trƣởng chiều cao đạt giá trị cao nhất là 25,23mm ở nồng độ BAP 1,5mg/l và thấp nhất là ở công thức đối chứng với 3,68mm. Sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối tăng dần khi tăng nồng độ BAP lên 0,5mg/l, 1mg/l và 1,5mg/l. Khi tăng nồng độ BAP cao hơn so với 1,5mg/l thì sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối có xu hƣớng giảm dần.
Một điều đặc biệt hơn cả là trong thí nghiệm này chƣa có bổ sung các loại Auxin, tuy nhiên thấy rằng có sự phát sinh rễ đạt tỉ lệ là 100% sau 8 tuần nghiên cứu. Cụ thể là số rễ trung bình tăng từ 3,28 rễ đến 9,89 rễ khi môi trƣờng nuôi cấy có sự thay đổi nồng độ BAP từ 0mg/l (ĐC) đến 1,5mg/l (B15). Số rễ trung bình đạt giá trị lớn nhất là 9,89 rễ trong môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 1,5mg/l BAP, khi nồng độ BAP vƣợt quá 1,5mg/l ta thấy giá trị số rễ trung bình ở các công thức B2 và B25 đã giảm đáng kể.
Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm đƣợc thể hiện ở biểu đồ dƣới đây:
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển thân
Số lá sau 8 tuần cũng có sự chênh lệch đáng kể và tăng giảm không ổn định giữa các môi trƣờng có nồng độ BAP khác nhau. Dƣới đây là bảng số liệu và biểu đồ thể hiện số lá trong 3 giai đoạn nghiên cứu:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BA đến số lá
Từ bảng 3.2 và hình 3.4 thấy rằng, luôn có sự tăng lên về số lƣợng lá sau 4 tuần và 8 tuần. Khả năng tăng trƣởng về số lá cao nhất là ở công thức B15, số là đạt từ 3,45 lá (0 tuần) đến 4,8 lá (4 tuần) và tăng đến 5,75 lá ở tuần thứ 8. Khi tăng nồng độ BAP lên cao hơn 1,5mg/l thì số lá có giá trị thấp hơn (B2, B25). Và ở công thức đối chứng luôn ta thấy số lá có giá trị nhỏ nhất so với ở các môi trƣờng khác có bổ sung BAP trong cả 3 giai đoạn 0 tuần, 4 tuần và 8 tuần.
Công thức 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần
ĐC 3,20 3,45 3,45 B05 3,70 4,35 4,70 B1 3,35 3,90 4,50 B15 3,45 4,80 5,75 B2 3,40 4,31 4,88 B25 3,30 3,56 4,90
Từ kết quả phân tích trên có thể nhận thấy trong thí nghiệm này công thức đối chứng luôn cho giá trị nhỏ nhất, công thức B15 là công thức thích hợp nhất để phát triển thân, phát sinh rễ và đạt nhiều lá trong điều kiện nuôi cấy in
vitro loài lan Trầm. Tuy nhiên có thể sử dụng công thức B2 để nhân nhanh
chồi, vì trên công thức này hệ số nhân chồi là cao nhất.
3.1.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) Trầm (D. nestor)
Trong thí nghiệm này, có sự thay đổi các nồng độ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l. Sau thời gian theo dõi mẫu cấy, đã xác định đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức
Hệ số nhân (lần)
Sinh trưởng chiều cao tư ng đối (mm)
Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ (rễ) ĐC 1,80 3,60 100 3,28 K05 2,65 5,63 100 6,50 K1 2,56 7,33 100 7,76 K15 2,44 9,96 100 7,16 K2 2,63 10,63 100 8,47 K25 2,60 15,37 100 8,85
Kết quả phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt về hệ số nhân giữa các công thức thí nghiệm: Công thức đối chứng có hệ số nhân là thấp nhất (1,8 lần). Kinetin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ 0,5mg/l (K05) là môi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi với hệ số nhân là cao nhất đạt 2,65 lần. Khi tăng nồng độ Kinetin bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy lên 1mg/l (K1) và 1,5mg/l (K15) thì hệ số nhân giảm dần xuống 2,56 lần và 2,44 lần; nhƣng khi tăng nồng độ Kinetin lên 2mg/l và 2,5mg/l thì hệ số nhân lại tăng lên.
Một số biều đồ mô phỏng sự thay đổi hệ số nhân và sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối trong các môi trƣờng khác nhau:
Hình 3.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến hệ số nhân chồi
ĐC K05
K1 K15
K2 K25
Hình 3.6. Chồi cây in vitro trên các môi trường có bổ sung BAP và trên môi trường đối chứng
Hình 3.7. Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát triển thân
Qua bảng 3.3 và hình 3.7 ta thấy sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối có giá trị cao nhất trên môi trƣờng bổ sung Kinetin với nồng độ 2,5mg/l (B25) đạt 15,37mm. Khi giảm đi nồng độ Kinetin trong môi trƣờng nuôi cấy xuống 2mg/l (B2), 1,5mg/l (B15), 1mg/l (B1), 0,5mg/l thì sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối cũng giảm dần xuống 10,63mm, 9,96mm, 7,33mm, 5,63mm. Tất cả đều cao hơn so với sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối ở công thức đối chứng.
Giống nhƣ ở thí nghiệm có bổ sung BAP, trong thí nghiệm này ta cũng thấy rằng tỉ lệ phát sinh rễ đạt 100%. Số rễ tăng dần khi ta tăng nồng độ Kinetin và đạt giá trị cao nhất là 8,85 rễ ở nồng độ 2,5mg/l.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần
ĐC 3,20 3,45 3,45 K05 3,55 3,90 4,20 K1 3,75 4,60 4,85 K15 3,90 4,50 4,70 K2 3,95 4,50 4,70 K25 3,60 4,40 4,75
So với thí nghiệm 1 có sử dụng BAP, thì ta thấy sử dụng Kinetin có sự ổn định hơn về sự phát sinh lá, tuy nhiên hiệu quả không bằng BAP. Số liệu cụ thể đƣợc thể hiện ở bảng 3.4 và hình 3.8.
Sự tăng trƣởng của số lá khi sử dụng môi trƣờng có bổ sung 1mg/l Kinetin là cao nhất, Ở giai đoạn 0 tuần có giá trị 3,75 nhƣng sau 4 tuần và 8 tuần thì số lá lần lƣợt là 4,6 lá và 4,85 lá. Khi tăng nồng độ Kinetin lên 1,5mg/l, 2mg/l và 2,5mg/l thì sự tăng trƣởng về số lá giảm đi so với môi trƣờng có nồng độ Kinetin là 1mg/l Kinetin. Giá trị tăng trƣởng của số lá thấp nhất là ở công thức đối chứng; số lá đạt 3,2 lá ở 0 tuần, khi lên 4 tuần đạt 3,45 lá và 8 tuần là 3,45 lá.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của BA đến số lá
Nhƣ vậy, bổ sung Kinetin ở nồng độ 0,5mg/l cho hệ số nhân tốt nhất. Ngoài ra, để có đƣợc sự sinh trƣởng tƣơng đối cao nhất và số rễ phát sinh nhiều nhất thì cần bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ Kinetin là 2,5mg/l.
3.1.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa BAP và Kinetin đến sự phát triển thân của cây in vitro lan Trầm (D. nestor)
Trong thí nghiệm này sử dụng nồng độ 1mg/l BAP kết hợp với 1mg/l Kinetin để so sánh với công thức đối chứng không sử dụng chất điều hòa sinh
trƣởng, trong điều kiện cùng môi trƣờng nền. Kết quả thu thập đƣợc thống kê trong bảng 3.5 dƣới đây:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng sự phối hợp của BAP và Kinetin đến hệ số nhân và sự phát triển thân của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức
Hệ số nhân (lần)
Sinh trưởng chiều cao tư ng đối (mm)
Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ (rễ) ĐC 1,80 3,60 100 3,28 K1B1 2,72 21,83 100 9,72
Hình 3.9. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến hệ số nhân chồi
ĐC K1B1
Hình 3.10. Chồi cây in vitro trên môi trường có bổ sung kết hợp BAP với Kinetin và trên môi trường đối chứng
Qua kết quả bảng 3.5 nhận thấy: Có sự chênh lệch rõ rệt giữa công thức đối chứng và công thức có sự kết hợp của BAP và Kinetin. Về hệ số nhân
chồi ở công thức B1K1 là 2,72 lần, cao hơn so với công thức đối chứng (1,8 lần). Hình 3.9 mô phỏng sự thay đổi hệ số nhân trên 2 môi trƣờng này.
Đặc điểm về sự sinh trƣởng tƣơng đối giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt. Ở công thức K1B1 là 21,83mm, cao hơn gấp 6,06 lần so với công thức đối chứng có giá trị là 3,6mm. Điều này đƣợc thể hiện rõ trong hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến sự phát triển thân
Dựa vào bảng 3.5 ta thấy rằng khi có sự kết hợp giữa BAP và Kinetin thì số rễ trung bình đạt giá trị cao hơn so với cả công thức đối chứng lẫn cả hai thí nghiệm 1 và 2 với giá trị cụ thể là 9,72 rễ.
Số lá cũng có sự khác biệt giữa hai công thức này. Dƣới đây là bảng số liệu và hình:
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của Kinetin đến số lá của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần
ĐC 3,2 3,45 3,45
Hình 3.12. Ảnh hưởng sự kết hợp của BA và Kinetin đến số lá
Qua bảng 3.6 và hình 3.12 trên thấy rằng, sự tăng trƣởng của số lá ở môi trƣờng có kết hợp cả hai loại phytohoocmon là 3,35 lá ở 0 tuần, 4,05 lá ở 4 tuần và 4,9 lá ở 8 tuần; cao hơn so với công thức đối chứng (3,2 lá ở 0 tuần, 3,45 lá ở 4 tuần, 3,45 lá ở 8 tuần).
Vậy khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ 1mg/l BAP và 1mg/l Kinetin thu đƣợc hệ số nhân và chất lƣợng chồi tƣơng đối tốt.
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ và sự phối h p c c chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor)
3.2.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) (D. nestor)
Thử nghiệm đối với IBA, tôi thay đổi các nồng độ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy từ 0,25 mg/l đến 1,5 mg/l, kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.7.
Qua bảng 3.7 và hình 3.13, ta nhận thấy khi tăng nồng độ IBA từ 0,25 mg/l đến 1,5 mg/l thì số rễ thay đổi lớn ở nồng độ IBA là 0,25mg/l với giá trị số rễ trung bình là 10,25 rễ, đây là nồng độ có số rễ đạt giá trị lớn nhất trong thí nghiệm này. Khi tăng nồng độ IBA lên 0,5mg/l, 0,75mg/l, 1mg/l, 1,5mg/l thì giá trị số rễ giảm còn 8,6 rễ, 8,5 rễ, 8,53 rễ và 8,92 rễ. Các công thức này đều có giá trị cao hơn so với công thức đối chứng.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (mm) Khối lư ng cây (g) Tỉ lệ ph t sinh chồi (%) Hệ số nhân (lần) ĐC 5,77 38,45 1,31 73,33 2,00 I025 10,25 29,76 2,02 91,67 2,33 I05 8,60 36,38 3,18 86,67 2,13 I075 8,50 37,15 2,93 83,33 2,25 I1 8,53 34,51 2,31 73,33 2,27 I15 8,92 32,84 1,89 100 2,46
Bên cạnh việc phát sinh rễ mới, các rễ này còn có sự tăng lên về chiều dài. Cụ thể là ở công thức I025, chiều dài rễ đạt giá trị thấp nhất (29,76mm) và giá trị cao nhất là 38,45mm ở công thức đối chứng. Khi ta tăng nồng độ IBA lên 0,5mg/l và 0,75mg/l thì chiều dài rễ cũng tăng theo lên 36,38mm và 37,15mm. Nhƣng khi tiếp tục tăng nồng độ IBA lên 1mg/l và 1,5mg/l thì chiều dài rễ giảm dần còn 34,51mm và 32,84mm. Qua đây thấy đƣợc rằng IBA ảnh hƣởng không nhiều tới việc tăng chiều dài rễ của rễ.
Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm đƣợc mô phỏng qua hình 3.13.
ĐC I025
I05 I075
I1 I15
Hình 3.14. Rễ cây in vitro trên các môi trường có bổ sung IBA
Ngoài nghiên cứu về rễ, tôi còn chú ý đến sinh khối của cây con in vitro.
Sau khi sử dụng cân phân tích để cân khối lƣợng của cây, đã thu đƣợc số liệu nhƣ hình 3.15. Ở công thức đối chứng có khối lƣợng cây là nhỏ nhất (1,31g), khối lƣợng cây tăng từ 2,02g lên 3,18g khi tăng nồng độ IBA từ 0,25mg/l lên 0,5mg/l. Tiếp đến, khi tăng thêm nồng độ IBA ở các công thức I075, I1, I15 thì thấy đƣợc khối lƣợng cây có xu hƣớng giảm dần.
Bên cạnh đó, dù trong quá trình này chỉ bổ sung Auxin nhƣng vẫn phát sinh thêm chồi mới với tỷ lệ phát sinh chồi khá cao và có hệ số nhân đều lớn hơn 2. Dựa vào bảng 3.7 ở trên ta nhận thấy, tỉ lệ phát sinh chồi là thấp nhất với 73,33% ở công thức đối chứng và công thức I15 với hệ số nhân lần lƣợt là
2 lần và 2,27 lần. Tỉ lệ phát sinh chổi đạt giá trị cao nhất (100%) và hệ số nhân cao nhất (2,46 lần) ở môi trƣờng có bổ sung 1,5mg/l IBA.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây
Nhƣ vậy, môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung IBA ở nồng độ 0,25mg/l là môi trƣờng thích hợp cho khả năng ra rễ của cây con in vitro loài lan Trầm.
3.2.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây in vitro lan Trầm (D. nestor) (D. nestor)
Trong thí nghiệm này tôi bổ sung NAA vào môi trƣờng nuôi cấy với các nồng độ: 0,25mg/l, 0,5mg/l, 0,75mg/l, 1mg/l, 1,5mg/l. Tiến hành theo dõi mẫu cấy, xác định môi trƣờng thích hợp để giai đoạn ra rễ đạt kết quả tốt nhất. Kết quả đƣợc thống kê ở bảng nhƣ sau:
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của cây in vitro loài lan Trầm (D. nestor)
Công thức Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (mm) Khối lư ng cây (g) Tỉ lệ ph t sinh chồi (%) Hệ số nhân (lần) ĐC 5,77 38,45 1,31 73,33 2,00 N025 10,27 33,95 3,06 100 2,47 N05 9,56 36,47 1,73 77,78 2,11 N075 9,08 29,18 2,04 83,33 2,58 N1 8,27 30,48 2,27 93,33 2,33 N15 9,93 32,47 3,53 93,33 2,47
ĐC N025
N05 N075
N1 N15
Hình 3.16. Rễ cây in vitro trên các môi trường có bổ sung NAA
Kết quả phân tích cho thấy, tƣơng tự nhƣ đối với IBA, khi nồng độ NAA trong môi trƣờng là 0,25mg/l thì cây đạt số rễ nhiều nhất là 10,27 rễ, lớn hơn so với IBA ở cùng nồng độ. Ở các công thức N05, N075, N1, N15 có số rễ lần lƣợt là 9,56 rễ, 9,08 rễ, 8,27 rễ và 9,93 rễ. Giá trị số rễ nhỏ nhất là 5,77 rễ trong môi trƣờng công thức đối chứng.
Giống nhƣ ở thí nghiệm 4, chiều dài rễ ở công thức đối chứng là lớn nhất (38,45 rễ) nhƣng khối lƣợng cây và hệ số nhân chồi lại là thấp nhất so với các công thức khác. Khối lƣợng cây cao nhất là ở môi tƣờng nuôi cấy có nồng độ NAA là 1,5mg/l. Tƣơng tự nhƣ ở thí nghiệm 4, cây in vitro trong thí nghiệm này cũng có sự phát sinh chồi, tỉ lệ phát sinh chồi tƣơng đối cao, nhỏ nhất là ở
công thức đối chứng (73,33%) và lớn nhất là ở công thức N025 (100%). Hệ số nhân có giá trị là lớn nhất ở công thức N075 với hệ số 2,58 lần.
Hình 3.17. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ
Hình 3.18. Ảnh hưởng của IBA đến khối lượng cây
Nhƣ vậy, bổ sung NAA ở nồng độ 0,25mg//l cho khả năng ra rễ là cao nhất trong thí nghiệm này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Khi so sánh giữa các nồng độ BAP khác nhau, môi trƣờng có bổ sung 2 mg/l BAP là môi trƣờng cho hệ số nhân chồi cao nhất (3 lần), sự phát triển thân đạt kết quả cao trên môi trƣờng bổ sung 1,5mg/l BAP (sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối là 25,23 mm).
Giữa các nồng độ Kinetin nghiên cứu, môi trƣờng có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin là môi trƣờng thích hợp nhân nhanh chồi, hệ số nhân đạt 2,65 lần, tuy nhiên, chồi nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung 2,5mg/l có sự sinh trƣởng chiều cao tƣơng đối là cao nhất (15,37 mm).
Khi có sự kết hợp giữa BAP và Kinetin thì số rễ/cây cao hơn so với sử