CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất thiên nhiên
2.2.2.1 Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh thường được sử dụng để tinh chế chất rắn bên cạnh các phương pháp khác như phương pháp sắc ký. Theo nguyên tắc thường các chất rắn tan tốt hơn trong dung môi ở nhiệt độ cao và tan kém ở nhiệt độ thấp hơn. Dựa theo nguyên tắc này, chất rắn được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi ở nhiệt độ cao rồi làm lạnh dung dịch, ở nhiệt độ thấp hơn, dung dịch trở nên quá bão hòa và chất rắn sẽ kết tủa [2].
Trong kỹ thuật kết tinh còn có thể sử dụng hỗn hợp dung môi trong đó dung môi hòa tan tốt hơn chất cần kết tinh dễ bay hơi hơn; khi để dung dịch bay hơi chậm sẽ dần dần đạt tới quá bão hòa và chất rắn sẽ kết tinh [2].
2.2.2.2 Phương pháp sắc ký Sắc ký lớp mỏng: M: Hỗn hợp chất ban đầu A, B: Các vệt chất được phân tách Hình 2.1. Minh họa sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, acetone, MeOH, EtOH.
Thuốc thử hiện màu được sử dụng là ceri sulfate.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ được dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị trí khác nhau trên đường đi của dung môi. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn [7].
Độ linh động của chất được đánh giá thông qua hệ số Rf.
Trong trường hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) = lA
l ; Rf(B) = lB l.
Hai chất A, B được coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký TLC có Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
Sắc ký cột:
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230- 400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như
n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.
Nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn.
Rf= Quãng đường di chuyển của chất Quãng đường di chuyển của dung môi
Hình 2.2. Minh họa sắc ký cột 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên
2.2.3.1 Phổ hồng ngoại
Sự hấp thụ ánh sáng hồng ngoại dẫn tới sự dao động không ngừng của các nguyên tử trong phân tử làm cho độ dài liên kết bị dãn ra, co lại và góc liên kết cũng bị thay đổi [3].
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng khoảng từ 104 đến 106 m, nằm giữa vi sóng và vùng ánh sáng khả kiến. Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng để xác định cấu trúc nằm giữa 2,5.10 4và 1,6.105 m. Hai đại lượng bước sóng (µm) và số sóng (cm1) được sử dụng phổ biến trong phổ hồng ngoại. Với bước sóng được ghi ở vùng từ 2,5µm đến 16µm và số sóng ứng với vùng từ 4000 đến 625 cm1 [3].
Khi xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, các pic nằm trong vùng từ 4000 đến 650 cm1 thường được quan tâm đặc biệt vì trong vùng này chứa các giải hấp thụ của các nhóm chức như : -OH, -C=O,….và được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ dưới 1500 cm1 được gọi là vùng vân ngón tay do vùng phổ này phức tạp hơn và dùng để nhận dạng toàn phân tử. Bảng 3.2 dẫn ra các tần số (theo số sóng) hấp
thụ hồng ngoại đặc trưng cho các nhóm chức thường gặp trong hợp chất hữu cơ [3].
Bảng 2.1 Tần số hấp thụ hồng ngoại của một số nhóm nguyên tử
Liên kết đơn Liên kết đôi, ba
Nhóm nguyên tử Tần số, cm1 Nhóm nguyên tử Tần số, cm1
Dao động hóa trị Dao động hóa trị –O–H (alcohol) 3200 – 3600 C=C 1620 – 1680 –O–H (carboxylic acid) 2500 – 3600 C=O 1710 – 1750 3350 – 3500 Aldehyde và ketone 1700 – 1725 sp C–H 3310 – 3320 Carboxylic acid 1800 – 1850 và 1740 – 1790 sp2 C–H 3000 – 3100 Anhydride acid 1770 – 1815 sp3 C–H 2850 – 2950 Axyl halide 1730 – 1750 sp2 C–O 1200 Amide 1680 - 1700 sp3 C–O 1025 – 1200
Dao động biến dạng với giá trị dự đoán Dao động biến dạng với giá trị dự đoán Alkene C C 2100 – 2200 RCH=CH2 910, 990 C N 2240 – 2280 R2C=CH2 890 Dẫn xuất thế của bezen cis – RCH=CHR’ 665 – 730 Thế một lần 730 – 770 và 690 – 710 trans – RCH=CHR’ 960 – 980 o – hai lần thế 735 – 770 R2C=CHR’ 790 – 840 m – hai lần thế 750 – 810 và 680 – 730 p – ba lần thế 790 – 840
2.2.3.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài [3].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
- Số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học, H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trường bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Cường độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác J cho biết proton nào tương tác với proton nào. Số lượng tín hiệu (vạch phổ): Ứng với mỗi phân tử đã cho, các proton với cùng điều kiện xung quanh như nhau, tức là có cấu tạo hóa học như nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường như nhau; các proton có điều kiện khác nhau, tức là có cấu tạo hóa học khác nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường khác nhau. Số lượng tín hiệu trong phổ NMR cho ta biết số lượng tập hợp proton tương đương, hay là bao nhiêu “loại” proton.
Vị trí vạch phổ: Đối với số lượng tín hiệu cho ta biết trong phân tử chứa bao nhiêu loại proton thì vị trí của vạch phổ cho ta biết chúng thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc 1,…Các loại proton khác nhau thì có môi trường electron bao quanh khác nhau và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Khi xét proton riêng biệt thì proton bị che chắn đỏi hỏi cường độ từ trường ngoài cao hơn và proton bị phản chắn đòi hỏi cường độ từ trường ngoài thấp hơn để tạo ra cường độ từ trường hiệu dụng riêng khi sự hấp thụ xảy ra. Sự che chắn hay phản chắn làm cho sự hấp thụ chuyển dịch về phía trường cao hay trường thấp trong phổ NMR được gọi là độ chuyển dịch hóa học. Độ chuyển dịch hóa học ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS được gán = 0 ppm. Độ chuyển dịch hóa học của một số loại proton trong phân tử chất hữu cơ được minh họa qua Hình 2.3 [15].
Hình 2.3. Độ chuyển dịch hóa học của proton
Cường độ tín hiệu: Được thể hiện kích thước của pic hấp thụ, diện tích của một tín hiệu tỷ lệ thuận với số lượng proton tạo ra tín hiệu đó, từ đó cho ta xác định được số proton cùng loại.
Sự tương tác (tách vạch phổ) và hằng số tương tác J cho biết proton nào tương tác với proton nào.
Số vạch phổ được tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tương tác. Cường độ các vạch phổ được tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal [11]. Ví dụ trên phổ 1H-NMR của ethylbenzene, tín hiệu của nhóm CH3 có dạng triplet, nhóm CH2 có dạng quartet.
Hình 2.5. Phổ 1H-NMR của ethylbenzene
Phổ cộng hưởng từ nhân carbon-13 (13C-NMR):
Cho nhiều loại thông tin trực tiếp về khung carbon mà không có proton gắn với nó.
Số lượng tín hiệu cho biết có bao nhiêu nhóm carbon trong phân tử.
Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa, môi trường electron bao quanh mỗi carbon.
Hình 2.6. Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13
DEPT
Đây là kỹ thuật ghi phổ hỗ trợ cho phổ 13C-NMR.
Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hidro là vân đơn (s). Thông thường các máy đo phổ 13C-NMR sử dụng kỹ thuật xóa tương tác nên mỗi tín hiệu của C chỉ còn 1 vạch; trong kỹ thuật ghi phổ DEPT-90; các nhóm CH ở phía trên; trong DEPT-135 các nhóm CH, CH3 ở phía trên, CH2 ở phía dưới, C bậc 4 không xuất hiện tín hiệu trên phổ.
Hình 2.7. Phổ DEPT của ethylbenzene
2.2.3.3 Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối lượng (MS-Mass Spectrum) dựa trên sự ion hóa các phân tử. Các ion được phân tách dựa trên tỉ lệ khối lượng/điện tích (m/z). Một số kỹ thuật được sử dụng để ion hóa phân tử gồm phương pháp EI (Electron Impact- va chạm điện tử), ESI (Electrospray Impact-phun mù điện tử) [3].
Phương pháp EI thường áp dụng cho các hợp chất có phân tử khối nhỏ và phân tử sẽ bị ion hóa rồi phân tách thành các mảnh ion nhỏ hơn. Ví dụ, hợp chất ethylbenzene có M = 106; trên phổ EI-MS Error! Reference source not found. c ho pic M+m/z= 106 và ion mảnh có m/z= 91.
Hình 2.8. Phổ EI-MS của ethylbenzene
Phương pháp ESI thường áp dụng cho các hợp chất có phân tử khối lớn hơn và thu trên phổ đồ cho tín hiệu các ion giả phân tử như [M+H]+, [M+Na]+, …
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu hái, xử lý mẫu và điều chế các cặn chiết
Lá cây Bần giác sau khi được thu hái đem rửa sạch, để khô nước, đem thái nhỏ. Phơi mẫu cây trong điều kiện không có nắng mặt trời trực tiếp.
Hình 3.1. Lá cây Bần giác sau khi được phơi khô, xay nhỏ
Xay nhỏ mẫu lá cây thu được 971,61 gam. Cho mẫu lá cây Bần giác vào 2 bình thủy tinh dung tích 5L, đổ dung môi n-hexane ngập mẫu (tổng số 8 L n- hexane). Để qua đêm trong thời gian 24h. Sau đó tiến hành lọc lấy dịch chiết n- hexane qua vải lọc lần 1 và giấy lọc lần 2. Gộp các dịch chiết, đem chưng cất dưới hệ thống cất quay có áp suất giảm. Thu hồi dung môi n-hexane để ngâm tiếp và bổ sung thêm dung môi n-hexane cho ngập mẫu. Tiến hành lặp lại tổng số 6 lần ngâm mẫu. Sau khi chưng cất dưới áp suất giảm thu được 12,0 gam cặn chiết n- hexane của lá cây Bần giác (kí hiệu OELH).
Mẫu lá cây Bần giác tiếp tục được ngâm chiết với dung môi EtOAc với tổng số 6L/lần ngâm, để qua đêm 24h rồi tiến hành lọc qua vải, lọc qua giấy lọc. Cất
quay dịch chiết EtOAc dưới áp suất giảm, dung môi thu hồi tiếp tục được ngâm lại mẫu. Lặp lại quá trình ngâm chiết với EtOAc, tổng số 6 lần ngâm mẫu và thu được 20,14 gam cặn EtOAc lá cây Bần giác (kí hiệu OELE) (Hình 3.2).
Hình 3.2. Quá trình ngâm mẫu lá cây Bần giác trong dung môi n – Hexane
Tiếp tục lặp lại quá trình ngâm chiết với dung môi MeOH. Kết quả thu được 71,97 gam cặn MeOH (kí hiệu OELM).
Hình 3.4. Chưng cất dịch chiết dưới hê ̣ thống cất quay có áp suất giảm
Hình 3.5. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Bần giác
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n – hexane
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
+ Triển khai sắc ký lớp mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn dịch chiết n – hexane của lá cây Bần giác hòa tan trong hỗn hợp EtOAc- Hexane . Pha hệ dung môi (2 mL) rồi đổ vào bình triển khai sắc ký. Sử dụng bản mỏng với kích thước 15 mm x 40 mm. Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản mỏng 6 mm và cách đều hai bên mép bản, để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai. Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 3 mm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
+ Lập sắc ký đồ: Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254 nm và 366 nm. Phun thuốc thử Ce(SO4)2, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Lá cây Bần giác (OEL; 971,61g) Dịch n-hexane Bã n-hexane 8L x 24h x 6 lần Cất quay dưới P giảm Cặn n-hexane OELH; 12g Dịch EtOAc Cất quay dưới P giảm Cặn EtOAc OELE; 20,14g Bã EtOAc 6L x 24h x 6 lần Dịch MeOH Cất quay dưới P giảm Cặn MeOH OELM; 71,97g Bã MeOH, 6L x 24h x 4 lần
Mỗi vết tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong cặn chiết, đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silica gel.
Các bản mỏng sau khi được triển khai sắc ký, hiện màu bằng đèn tử ngoại sau đó phun thuốc thử Ce(SO4)2 thu được kết quả tương ứng như sau (Hình 3.6):
Hình 3.6. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n – hexane lá cây Bần giác
Kết quả so sánh cho thấy các chất được khai triển tốt nhất ở hệ dung môi (V) và nhiều vệt chất hiện màu với thuốc thử Ce(SO4)2 và hiện UV ở các bước sóng = 254 nm, 366 nm.
Ce(SO4)2 UV-254 UV-366 EA/n-Hexane 20%
Hình 3.7. TLC cặn n – hexane lá cây Bần giác với hệ dung môi EA/n-hexane 20%
Do đó, lựa chọn hệ dung môi EA/n-hexane với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn n – hexane của lá cây Bần giác.
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Bước 1: Chuẩn bị cột
Sử dụng cột có đường kính 6 cm, chiều dài 50 cm được rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt:
Cân 250 gam silica gel, ngâm trương nở ngập trong n-hexane khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 3h.
Bước 2: Đưa chất lên cột
12 gam cặn chiết n – hexane (kí hiệu OELH) được hòa với n – hexane vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 15 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.8).
Hình 3.8. Cột tổng silica gel cặn n – hexane
Bước 3: Tiến hành rửa giải
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi EA/n-Hexane gradient (0-20%). Hứng dung dịch rửa giải khoảng 80-100 mL vào mỗi bình nón.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi MeOH. Kết quả thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ OELHF1-OELHF6 (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng n – hexane
STT Bình gộp Phân đoạn Khối lượng (gam)
1 1÷9 OELHF1 2,17
2 10÷20 OELHF2 0,4
3 21÷39 OELHF3 0,89
4 40 ÷ 48 OELHF4 0,39